Οι συσταδοποιημένες, τακτικά διασταυρούμενες, βραχείες παλινδρομικές επαναλήψεις (CRISPR) είναι μια τεχνική επεξεργασίας γονιδιώματος τρίτης γενιάς που έχει φέρει επανάσταση στον κόσμο με τα αποτελέσματα υψηλής απόδοσης. Έχει χρησιμοποιηθεί για τη θεραπεία διαφόρων βιολογικών ασθενειών και λοιμώξεων. Διάφορα βακτήρια και άλλοι προκαρυώτες (όπως τα αρχαία) διαθέτουν επίσης συστήματα CRISPR/Cas9 για την άμυνα έναντι των φάγων. Έχει αναφερθεί ότι οι στρατηγικές που βασίζονται στο CRISPR/Cas9 μπορούν να αναστείλουν την ανάπτυξη και την εξέλιξη του τριπλά αρνητικού καρκίνου του μαστού (TNBC) στοχεύοντας δυνητικά τροποποιημένα γονίδια αντοχής, μεταγραφή και επιγενετική ρύθμιση. Αυτές οι θεραπευτικές παρεμβάσεις μπορούν να βοηθήσουν στην αντιμετώπιση δύσκολων προβλημάτων, όπως η αντοχή στα φάρμακα που παρατηρείται ακόμη και στο TNBC. Επί του παρόντος, χρησιμοποιούνται διάφορες μέθοδοι για την παροχή CRISPR/Cas9 σε κύτταρα-στόχους, όπως φυσικές (μικροέγχυση, ηλεκτροπόρωση και υδροδυναμικές μέθοδοι), ιικές (αδενο-σχετιζόμενος ιός και φακοϊός) και μη ιικές (λιποσώματα και νανοσωματίδια λιπιδίων). Παρόλο που έχουν αναπτυχθεί διάφορα μοντέλα για τη μελέτη των μοριακών αιτιών του TNBC, η έλλειψη ευαίσθητων και στοχευμένων μεθόδων για την παροχή εργαλείων επεξεργασίας γονιδιώματος in vivo περιορίζει την κλινική τους εφαρμογή. Συνοψίζοντας, αυτή η ανασκόπηση εξετάζει διεξοδικά την πρόοδο, τις προκλήσεις, τους περιορισμούς και τις προοπτικές της θεραπείας CRISPR/Cas9 για το TNBC με βάση τα υπάρχοντα στοιχεία. Επισημαίνουμε επίσης πώς ο συνδυασμός τεχνητής νοημοσύνης και μηχανικής μάθησης μπορεί να βελτιώσει τις στρατηγικές CRISPR/Cas9 στη θεραπεία του TNBC.
Ο καρκίνος χαρακτηρίζεται από ανεξέλεγκτη κυτταρική διαίρεση, διαταραχή των σημείων ελέγχου του κυτταρικού κύκλου και μεταλλάξεις σε γονίδια καταστολής όγκων (TSGs) (Matthews et al., 2022). Μεταξύ των διαφόρων τύπων καρκίνου, ο καρκίνος του μαστού είναι ο πιο συνηθισμένος τύπος καρκίνου στις γυναίκες και έχει υψηλό ποσοστό θνησιμότητας παγκοσμίως (Waks and Winer, 2019). Ο καρκίνος του μαστού είναι μια ετερογενής ασθένεια με ποικίλα χαρακτηριστικά, όπως ιστολογικά και βιολογικά χαρακτηριστικά, κλινική εικόνα και συμπεριφορά, και ανταπόκριση στη θεραπεία (Weigelt et al., 2010). Η ταξινόμηση του καρκίνου του μαστού παρέχει ακριβείς πληροφορίες για τη διάγνωση του καρκίνου του μαστού και την πρόγνωση του όγκου. Η χρήση κοινών βιοδεικτών και κλινικοπαθολογικών χαρακτηριστικών αποτελεί το κύριο κριτήριο για την ταξινόμηση του καρκίνου του μαστού (Tsang and Tse, 2019). Η πρόγνωση και η ανταπόκριση στη θεραπεία του καρκίνου του μαστού επηρεάζονται από πολλούς παράγοντες, όπως η παρουσία υποδοχέα οιστρογόνων (ER), υποδοχέα προγεστερόνης (PR), υποδοχέα ανθρώπινου επιδερμικού αυξητικού παράγοντα 2 (HER2/neu) και ιστολογικό βαθμό, τύπο όγκου και βαθμό. μέγεθος και μετάσταση λεμφαδένων (Al-Tubaiti, 2020). Έχουν εντοπιστεί πέντε εγγενείς μοριακοί υποτύποι καρκίνου του μαστού, συμπεριλαμβανομένων του αυλού Α, του αυλού Β, του HER2-εμπλουτισμένου, του βασικού τύπου και του χαμηλού κλαουντίνου (Prat et al., 2015). Το TNBC είναι ένας μοριακός υποτύπος καρκίνου που δεν εκφράζει όλα τα ER, PR και HER2 (Yin et al., 2020). Αυτά τα παθολογικά χαρακτηριστικά σχετίζονται με το TNBC, επιβεβαιώνοντας την ταχεία εξέλιξή του και την πιο επιθετική φύση του από οποιονδήποτε άλλο τύπο καρκίνου του μαστού (Feng et al., 2018). Επιπλέον, οι Peru et al (2000) χρησιμοποίησαν τεχνολογία μικροσυστοιχιών για να αναταξινομήσουν τον καρκίνο του μαστού και να αναγνωρίσουν πέντε εγγενείς υποτύπους καρκίνου του μαστού (Cadenas, 2012). Ο βασικού τύπου καρκίνος του μαστού είναι ένας υποτύπος καρκίνου του μαστού που έχει τριπλά αρνητικό φαινότυπο και σχετίζεται με ταχεία εξέλιξη. Θα πρέπει να σημειωθεί ότι όλοι οι βασικοειδείς καρκίνοι του μαστού συνήθως διαγιγνώσκονται λανθασμένα ως TNBC, αλλά μόνο το 77% είναι TNBC. Αντίθετα, το 71–91% των TNBC είναι βασικοειδείς, υποδεικνύοντας ότι αυτοί οι δύο τύποι καρκίνου του μαστού αλληλεπικαλύπτονται και αντιπροσωπεύουν διαφορετικές ταξινομήσεις (Wang D.-Y. et al., 2019). Αυτό δημιουργεί την ανάγκη χαρακτηρισμού της ετερογένειας των TNBC για τη διευκρίνιση της πρόγνωσης και τον εντοπισμό πιθανών αντιδράσεων σε τρέχουσες και μελλοντικές θεραπείες. Επιπλέον, τα TNBC αντιπροσωπεύουν το 15–20% όλων των περιπτώσεων καρκίνου του μαστού και είναι πιο συχνά σε γυναίκες κάτω των 50 ετών. Μεταλλάξεις BRCA1 ή BRCA2 έχουν αναφερθεί σε περίπου 20% των περιπτώσεων TNBC (Xie et al., 2017; Tzikas et al., 2017). , 2020). Μελέτες έχουν επίσης δείξει ότι το TNBC έχει ένα ξεχωριστό ανοσοποιητικό μικροπεριβάλλον που περιλαμβάνει υψηλά επίπεδα αγγειακών ενδοθηλιακών αυξητικών παραγόντων, μακροφάγων που σχετίζονται με όγκους (TAMs), λεμφοκυττάρων που διηθούν όγκους (TILs) και άλλων μορίων που εμπλέκονται στην ανάπτυξη και τη μετανάστευση του όγκου. Επομένως, η κατανόηση του μικροπεριβάλλοντος του TNBC είναι κρίσιμη για την πρόγνωση και τη θεραπεία του (Fan and He, 2022).
Για την αξιολόγηση της πρόγνωσης του TNBC και τη διασφάλιση αποτελεσματικής θεραπείας, η ακριβής διάγνωση, που βασίζεται κυρίως στην ανοσοϊστοχημεία (IHC) για την ανίχνευση ER, PR και HER2, και η μαστογραφία για την ανίχνευση νεοπλασμάτων του μαστού, είναι σημαντική. Ωστόσο, η μαστογραφία δεν μπορεί να απεικονίσει επαρκώς τα ενδοογκικά χαρακτηριστικά όπως η νέκρωση και η ίνωση (Deepak Singh et al., 2021). Δεδομένου ότι η κακή πρόγνωση και η διάγνωση εμποδίζουν τους γιατρούς να συνταγογραφήσουν τα σωστά φάρμακα (Chaudhary, 2020), χρησιμοποιούνται διάφορες στρατηγικές για τη βελτίωση της φροντίδας των ασθενών με TNBC. Επί του παρόντος, δύο φάρμακα, η δοξορουβικίνη και η κυκλοφωσφαμίδη, χρησιμοποιούνται σε ασθενείς με TNBC και έχουν δείξει καλά αποτελέσματα. Επιπλέον, χρησιμοποιούνται και άλλα φάρμακα πλατίνας, όπως η καρβοπλατίνη και η σισπλατίνη (Sikov et al., 2015). Επιπλέον, αναστολείς PARP όπως η Olaparib, η Velaparib και το PF-01367338 έχουν χρησιμοποιηθεί ως πιθανά χημειοθεραπευτικά φάρμακα για τη θεραπεία του TNBC (Ishino et al., 2018). Δεδομένου ότι οι σηματοδοτικές οδοί Wnt/b-Catenin, NOTCH και Hedgehog έχουν αναφερθεί ότι εμπλέκονται στην εμφάνιση και την εξέλιξη του TNBC, η στόχευση φαρμάκων σε αυτές τις οδούς μπορεί να αποτελέσει μια σημαντική στρατηγική (Aysola et al., 2013). Παρόλο που η χειρουργική επέμβαση, η ακτινοθεραπεία και η χημειοθεραπεία παραμένουν ο βασικός πυλώνας της θεραπείας για το TNBC σήμερα, έχει σημειωθεί σημαντική πρόοδος στην ανάπτυξη νέων θεραπειών, συμπεριλαμβανομένης της στοχευμένης θεραπείας, της ανοσοθεραπείας, διαφόρων εργαλείων επεξεργασίας γονιδίων που σχετίζονται με το CRISPR, όπως Cas9n, dCas9, CRISPR/Cas12, prime editing και γονιδιακή θεραπεία που στοχεύει το CRISPR/Cas9. Εδώ θα επικεντρωθούμε σε διάφορα εργαλεία επεξεργασίας γονιδίων που σχετίζονται με το CRISPR και χρησιμοποιούνται στη θεραπεία του TNBC. Μεταξύ αυτών, το CRISPR/Cas9 έχει λάβει ευρεία προσοχή.
Η Cas9n, επίσης γνωστή ως νικάση Cas9, είναι μια γενετικά τροποποιημένη παραλλαγή της πρωτεΐνης Cas9 που προέρχεται από το σύστημα επεξεργασίας γονιδιώματος CRISPR/Cas9 (Gupta et al., 2019). Στην αρχική της μορφή, η πρωτεΐνη Cas9 περιέχει δύο τομείς νουκλεάσης: RuvC και HNH, η κύρια λειτουργία των οποίων είναι η διάσπαση και των δύο αλυσίδων DNA. Ωστόσο, στην Cas9n, μία από τις περιοχές νουκλεάσης, η HNH, μεταλλάσσεται γενετικά και καθίσταται ανενεργή. Επομένως, η περιοχή HNH της Cas9n παραμένει μη λειτουργική. Μόνο η περιοχή RuvC παραμένει ενεργή, επιτρέποντας στην Cas9n να κόβει ή να δημιουργεί θραύσεις σε μονές αλυσίδες DNA (Trevino and Zhang, 2014). Σε σύγκριση με την Cas9, η Cas9n μπορεί να μειώσει αποτελεσματικά τις επιδράσεις εκτός στόχου και να βελτιώσει με ακρίβεια τους μηχανισμούς επιδιόρθωσης κυττάρων. Η Cas9n μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την επίλυση διαφόρων προβλημάτων, όπως η δημιουργία θραυσμάτων σε συγκεκριμένες θέσεις στο δίκλωνο DNA. Για τον σκοπό αυτό, δύο μόρια Cas9n συνδυάστηκαν και χρησιμοποιήθηκαν μαζί (Yee, 2016). Η κινάση 3 μικτής γενεαλογίας (MLK3) είναι μια πρωτεϊνική κινάση που ενεργοποιείται από μιτογόνο και χρησιμεύει ως βασικός ρυθμιστής κατά τη διάρκεια της μετάστασης του TNBC (Cronan et al., 2012).
Η MLK3 μπορεί να ενεργοποιήσει πολλαπλές σηματοδοτικές οδούς που οδηγούν σε μετάσταση TNBC. Για παράδειγμα, η οδός c-Jun N-τελικής κινάσης (JNK) ρυθμίζει την κινητικότητα των κυττάρων και την αποικοδόμηση της εξωκυτταρικής μήτρας, και η MLK3 ενεργοποιεί την οδό JNK, ενισχύοντας έτσι την κινητικότητα των κυττάρων και προσδίδοντας ιδιότητες διήθησης (Rattanasinchai and Gallo, 2016). Η MLK3 ρυθμίζει επίσης την EMT. Για να το κάνει αυτό, ενεργοποιεί παράγοντες μεταγραφής κατάντη όπως Snail, Slug και Twist. Αυτοί οι παράγοντες αναστέλλουν την έκφραση επιθηλιακών δεικτών και προάγουν την έκφραση μεσεγχυματικών δεικτών, οδηγώντας στην απόκτηση ενός μεταστατικού φαινοτύπου (Casalino et al., 2023). Έχει παρατηρηθεί ότι η MLK3 παίζει ρόλο στην αναδιαμόρφωση της εξωκυττάριας μήτρας (ECM) και στην ενεργοποίηση πρωτεασών όπως οι μεταλλοπρωτεϊνάσες μήτρας (MMPs) που αποικοδομούν την ECM. Αυτό διευκολύνει την εισβολή των καρκινικών κυττάρων και την εξάπλωση σε απομακρυσμένες θέσεις (Katari et al., 2019). Έτσι, προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι η MLK3 παίζει κρίσιμο ρόλο στην TNBC. Οι Rattanasinchai και Gallo χρησιμοποίησαν μοντέλα TNBC για να μελετήσουν τον ρόλο του MLK3 και διαπίστωσαν ότι προάγει την ανάπτυξη του καρκίνου μέσω συγκεκριμένων σηματοδοτικών οδών. Χρησιμοποίησαν CRISPR/Cas9n για να επεξεργαστούν το MLK3 και παρατήρησαν σημαντική μείωση στη μετάσταση του TNBC (Rattanasinchai και Gallo, 2016).
Η dCas9, που συχνά ονομάζεται ανενεργή Cas9, είναι μια τροποποιημένη παράγωγη μορφή της πρωτεΐνης Cas9. Σε αντίθεση με την ενεργή Cas9, η dCas9 δεν έχει ενδονουκλεασική δράση, γεγονός που την καθιστά ανίκανη να προκαλέσει ρήξεις διπλής έλικας στο DNA. Επομένως, η dCas9 μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την ακριβή στόχευση συγκεκριμένων περιοχών του γονιδιώματος χωρίς αλλαγές ή τροποποιήσεις στην αλληλουχία DNA (Wang et al., 2016). Στην dCas9, δύο πρωτεΐνες ενδονουκλεάσης, η RuvC και η HNH, απενεργοποιούνται καταστέλλοντας σημαντικά υπολείμματα αμινοξέων. (Richter et al., 2016). Παρά την έλλειψη δράσης διάσπασης του DNA, η dCas9 παίζει έναν αριθμό σημαντικών ρόλων στη γενετική έρευνα και τη βιοτεχνολογία. Για παράδειγμα, επιτρέπει την οπτικοποίηση συγκεκριμένων περιοχών του γονιδιώματος, διευκολύνει τη μεταγραφική ρύθμιση και προάγει τις επιγενετικές τροποποιήσεις (Brocken et al., 2018).
Ο μεταγραφικός παράγοντας ZEB1 (ομοιοπεριοχή σύνδεσης E-box 1 του δακτύλου ψευδαργύρου) παίζει έναν συγκεκριμένο και κρίσιμο ρόλο στη μεσολάβηση της επιθηλιακής-μεσεγχυματικής μετάβασης (EMT), μιας κυτταρικής διαδικασίας που συμβαίνει κατά την εμβρυϊκή ανάπτυξη, την επιδιόρθωση των ιστών και την εξέλιξη του καρκίνου. Περιλαμβάνει τον μετασχηματισμό των επιθηλιακών κυττάρων σε μεσεγχυματικά κύτταρα, με αποτέλεσμα αλλαγές στη μορφολογία, την κινητικότητα, την διεισδυτικότητα των κυττάρων κ.λπ. (Wu et al., 2020). Το ZEB1 αναστέλλει πολλαπλούς επιθηλιακούς δείκτες, όπως η Ε-καδερίνη και η Οκλουδίνη, οι οποίοι είναι υπεύθυνοι για τη διατήρηση της κυτταρικής προσκόλλησης και της πολικότητας των επιθηλιακών κυττάρων στο TNBC (Moreno-Bueno et al., 2008). Επιπλέον, το ZEB1 ενεργοποιεί ορισμένους δείκτες όπως η Ν-καδερίνη, η βιμεντίνη και η φιμπρονεκτίνη (Konradi et al., 2014) και επίσης ρυθμίζει γονίδια που εμπλέκονται στην αναδιαμόρφωση του κυτταροσκελετού, όπως οι Rho GTPάσες και οι μεταλλοπρωτεϊνάσες μήτρας (MMPs) (Huang). et al., 2014). 2022), επιπλέον, επηρεάζει επίσης διάφορες σηματοδοτικές οδούς όπως τον μετασχηματιστικό αυξητικό παράγοντα-β (TGF-β), την σηματοδότηση Wnt, κ.λπ., προάγοντας έτσι την εισβολή του όγκου και τη μετάσταση σε TNBC (Chen et al., 2016). Πολυάριθμες μελέτες και επιστημονικά στοιχεία δείχνουν ότι το ZEB1 έχει μεγάλο δυναμικό ως πολύτιμος παράγοντας για την ανίχνευση και τη θεραπευτική παρέμβαση του TNBC. Σε μια πρόσφατη μελέτη, οι Waryah et al. χρησιμοποίησαν ένα μοντέλο TNBC και πέτυχαν πλήρη καταστολή του ZEB1 από το dCas9. Έτσι, παρατήρησαν πολύ υψηλή ειδικότητα και σχεδόν πλήρη αναστολή του ZEB1 σε συνθήκες in vivo (Waryah et al., 2023).
Το CRISPR/Cas12 είναι ένα εργαλείο επεξεργασίας γονιδίων που ονομάζεται CRISPR/Cpf1. Προέρχεται από το σύστημα CRISPR/Cas, όπου ο όρος Cas12 αναφέρεται στην πρωτεΐνη 12 που σχετίζεται με το CRISPR (Bharathkumar et al., 2022), η οποία είναι εντελώς παρόμοια με την Cas9. Η μόνη διαφορά είναι ότι περιέχει την πρωτεΐνη Cas12. Σε σύγκριση με την Cas9, η Cas12 έχει ορισμένες μοναδικές λειτουργίες, όπως η δημιουργία κολλωδών άκρων κατά τη διάρκεια της διαδικασίας επεξεργασίας γονιδίων, ενώ η Cas9 παράγει αμβλέα άκρα (Wang et al., 2021). Αυτή η ιδιότητα της Cas12 συμβάλλει στην ειδική τεχνολογία χειρισμού DNA. Ως πρωτεΐνη ικανή να αναγνωρίζει και να κόβει με ακρίβεια το DNA-στόχο, έχει εξαιρετική ευελιξία, καθιστώντας την ένα αποτελεσματικό εργαλείο για μια ποικιλία εφαρμογών, συμπεριλαμβανομένης της επεξεργασίας γονιδίων (Pickar-Oliver and Gersbach, 2019).
Όπως και άλλες παραλλαγές του CRISPR, το CRISPR/Cas12 είναι επίσης ικανό να απενεργοποιεί ή να ενεργοποιεί γονίδια στο TNBC, στοχεύοντας γονίδια που παίζουν σημαντικό ρόλο στην παθογένεσή του ή στην απόκριση στη θεραπεία (Yang and Zhang, 2023). Για να επιτευχθεί αυτή η διαδικασία, αναπτύχθηκε ένα οδηγό RNA (gRNA) που κατευθύνει το Cas12 στο γονίδιο-στόχο. Μόλις το Cas12 συνδεθεί με τον στόχο του, εισάγει ρήξεις διπλής έλικας στο DNA και ενεργοποιεί μηχανισμούς επιδιόρθωσης του DNA. Κατά τη διάρκεια της διαδικασίας επιδιόρθωσης, ενδέχεται να ενσωματωθούν λανθασμένα νουκλεοτίδια, οδηγώντας σε γονιδιακές μεταλλάξεις και απώλεια λειτουργίας (Zhang et al., 2021a). Επιπλέον, χρησιμοποιήθηκε επίσης μια βελτιωμένη έκδοση του ενζύμου Cas12 (που ονομάζεται dCas12) για την ενεργοποίηση γονιδίων. Συνδυάζοντάς το με έναν ενεργοποιητή μεταγραφής, είναι δυνατή η επαγωγή ορισμένων γονιδίων, ενεργοποιώντας τα έτσι. Αυτή η τεχνολογία έχει μεγάλο δυναμικό στην προώθηση της ενεργοποίησης γονιδίων καταστολής όγκων (Sultan et al., 2022).
Η πρωταρχική επεξεργασία είναι μια πρόσφατα αναπτυγμένη και εξαιρετικά ανώτερη τεχνολογία επεξεργασίας γονιδιώματος. Είναι ικανή να τροποποιήσει το DNA ενός οργανισμού με μεγάλη ακρίβεια (Chen and Liu, 2023). Η πρωταρχική επεξεργασία επιτυγχάνεται μέσω της ενσωμάτωσης δύο κύριων συστατικών: ενός τροποποιημένου ενζύμου CRISPR/Cas9 και μιας αντίστροφης μεταγραφάσης. Ο ρόλος του ενζύμου CRISPR/Cas9 είναι να στοχεύει επιλεκτικά ακριβείς θέσεις στο γονιδίωμα, ενώ η αντίστροφη μεταγραφάση βοηθά στην πλήρη τροποποίηση του DNA στη θέση-στόχο (Hassan et al., 2021). Στον μηχανισμό επεξεργασίας εκκινητών, το πρώτο βήμα περιλαμβάνει τη δημιουργία ενός RNA οδηγού επεξεργασίας εκκινητών (pegRNA) (Standage-Beier et al., 2021). Περιέχει την αλληλουχία-στόχο και το πρότυπο RNA που αντιστοιχεί στην επιθυμητή θέση επεξεργασίας στο DNA-στόχο. Το pegRNA εισάγεται στη συνέχεια στα κύτταρα-στόχους μαζί με μια νουκλεάση επεξεργασίας εκκινητών (PE2). Η PE2 είναι μια πρωτεΐνη σύντηξης που αποτελείται από ένα ένζυμο Cas9, μια αντίστροφη μεταγραφάση και έναν προσαρμογέα επεξεργασίας εκκινητών (Martín-Alonso et al., 2021). Μέσα στο κύτταρο, τα σύμπλοκα pegRNA και PE2 αναζητούν το συγκεκριμένο DNA που θέλουν να τροποποιήσουν. Το ένζυμο Cas9 κόβει το DNA και δημιουργεί ένα πρότυπο που αποτελείται από μονές αλυσίδες (Choi et al., 2022). Η αντίστροφη μεταγραφάση χρησιμοποιεί αυτό το πρότυπο για να προετοιμάσει το DNA για επεξεργασία. Μαζί με την αντιγραφή του DNA, περιλαμβάνονται επίσης οδηγίες για την επεξεργασία του προτύπου RNA. Τέλος, η νεοδημιουργημένη αλυσίδα DNA χρησιμοποιείται ως πρότυπο για την επιδιόρθωση του σπασίματος στο DNA, με αποτέλεσμα μια τροποποιημένη αλληλουχία DNA που περιέχει την επιθυμητή τροποποίηση (Ochoa-Sanchez et al., 2021). Οι μηχανισμοί επεξεργασίας primer μπορούν να οδηγήσουν σε εκτεταμένες μεταλλάξεις στα γονίδια. Μπορούν να στοχεύσουν σημειακές μεταλλάξεις, εισαγωγές, διαγραφές, ακόμη και αντικαταστάσεις γονιδίων (Anzalone et al., 2019; Chen and Liu, 2023). Η επεξεργασία prime προσφέρει πολλά πλεονεκτήματα σε σχέση με τις προηγούμενες τεχνολογίες επεξεργασίας γονιδιώματος. Αυτά περιλαμβάνουν αυξημένη ακρίβεια, μειωμένες επιδράσεις εκτός στόχου και την ικανότητα επεξεργασίας DNA χωρίς να βασίζεστε σε σπασίματα διπλής αλυσίδας DNA (Anzalone et al., 2020).
Η τεχνολογία CRISPR/Cas9 αναπτύχθηκε αρχικά για την προστασία των βακτηρίων από τη μεταφορά πλασμιδίων και τη μόλυνση από φάγους και αργότερα επαναχρησιμοποιήθηκε ως ένα αποτελεσματικό εργαλείο στόχευσης DNA που βασίζεται σε RNA για την επεξεργασία γονιδιώματος (Jiang and Doudna, 2017). Επιπλέον, το σύστημα CRISPR/Cas9 έχει αναφερθεί ότι υπάρχει στο 50% και 87% των βακτηριακών και αρχαϊκών γονιδιωμάτων, αντίστοιχα (Ishino et al., 2018). Το CRISPR/Cas9 είναι ένα πιθανό εργαλείο για τη διαγραφή, την εισαγωγή και τη διόρθωση οποιασδήποτε ανώμαλης γενετικής αλληλουχίας χρησιμοποιώντας in vivo και in vitro τρόπους (Sabit et al., 2021). Επιπλέον, το CRISPR/Cas9 έχει αποδειχθεί ότι αποτελεί μέρος του προσαρμοστικού ανοσοποιητικού συστήματος λόγω της εξειδίκευσής του για τα γονίδια-στόχους που μας ενδιαφέρουν (Chen and Zhang, 2018).
Το CRISPR/Cas9 αποτελείται από το Cas9 και ένα μόνο οδηγό RNA (sgRNA). Το Cas9 είναι μια ενδονουκλεάση που αποτελείται από πολλαπλά πρωτεϊνικά συστατικά. Επιπλέον, το Cas9 έχει μοναδικές δομικές και διαμορφωτικές ιδιότητες (Pacesa et al., 2022) καθώς αποτελείται από δύο λοβούς: αναγνώρισης (REC) και νουκλεάσης (NUC). Ο λοβός REC διαιρείται περαιτέρω σε τρεις περιοχές: REC1, REC2 και γεφυρικές έλικες (Cromwell et al., 2018). Το NUC αποτελείται από τρεις λοβούς, συγκεκριμένα τον RuvC (RuvC I, RuvC II, RuvC III), την HNH και την περιοχή αλληλεπίδρασης παρακείμενου μοτίβου πρωτοδιαχωριστή (PAM) (Εικ. 1) (Song et al., 2016). Το sgRNA αποτελείται από δύο συστατικά, συμπεριλαμβανομένου του CRISPR RNA (crRNA) και του μετακωδικοποιητικού μικρού RNA (RNA ιχνηθέτη) (Εικόνα 1). Το sgRNA συνδέει την πρωτεΐνη Cas9 με τις συνδεσίνες για να σχηματίσει ένα ενεργό σύμπλεγμα, γνωστό και ως σύμπλεγμα τελεστή (Richter et al., 2012). Το crRNA είναι ένα ζεύγος βάσεων 18-20 νουκλεοτιδίων που παίζει κρίσιμο ρόλο στην αναγνώριση αλληλουχιών DNA-στόχου. Επιπλέον, το crRNA ζευγαρώνει με το DNA-στόχο και το tracrRNA λειτουργεί ως ικρίωμα για την νουκλεάση Cas9 για να συνδεθεί με το DNA-στόχο (Manghwar et al., 2019). Από την άλλη πλευρά, η αλληλουχία PAM έχει 3 νουκλεοτίδια, τα οποία επιβεβαιώνουν, καθορίζουν και μεσολαβούν στη σύνδεση του συμπλέγματος τελεστή στο DNA. Οι υπομονάδες RuvC και HNH του συμπλέγματος πρωτεΐνης Cas9 έχουν καταλυτική δράση (Richter et al., 2012; Asmamaw and Zawdie, 2021). Η περιοχή νουκλεάσης HNH της υπομονάδας Cas9 διασπά την αλυσίδα DNA που σχετίζεται με το crRNA. Η περιοχή νουκλεάσης RuvC διασπά άλλες αλυσίδες DNA και δημιουργεί διπλές αλυσιδωτές θραύσεις (DSBs), μετά τις οποίες ενεργοποιούνται δύο διαφορετικοί μηχανισμοί επιδιόρθωσης θραύσης DNA (Jiang and Doudna, 2017) (Σχήμα 1).
Σχήμα 1. Επισκόπηση του CRISPR/Cas9 (Α). Συστατικά του συστήματος CRISPR/Cas9: (i). Η ενδονουκλεάση Cas9 είναι υπεύθυνη για την κοπή της αλληλουχίας DNA-στόχου, (ii) ενός μοναδικού οδηγού (sg) RNA που προκύπτει από τη σύντηξη χιμαιρικών μορίων crRNA και tra-crRNA. (δύο). Το Cas9 περιλαμβάνει πολλά συστατικά όπως το Rec I, το Rec II, τον λοβό NUC (HNH και Ruv C είναι υποσυστατικά) και τον τομέα αλληλεπίδρασης PAM (C) με αντίστοιχες λειτουργίες. Το σύμπλεγμα πρωτεΐνης CRISPR/Cas9 διασπά τις αλληλουχίες DNA σε μη συμπληρωματικές και συμπληρωματικές μορφές (D). Το CRISPR/Cas9 επεξεργάζεται το γονιδίωμα σε τρία στάδια: αναγνώριση, κοπή και επιδιόρθωση. Το σχεδιασμένο sg-RNA καθοδηγεί το Cas9 και αναγνωρίζει την επιθυμητή αλληλουχία μέσω του συμπληρωματικού συστατικού crRNA. Το Cas9 αναγνωρίζει την αλληλουχία PAM στο 5′-NGG-3′ και λιώνει το DNA, σχηματίζοντας ένα υβρίδιο DNA-RNA και ενεργοποιώντας τη διάσπαση. Η περιοχή HNH του Cas9 διασπά την συμπληρωματική αλυσίδα και η περιοχή RuvC διασπά την μη συμπληρωματική αλυσίδα. Η CRISPR/Cas9 επισκευάζει το dsDNA διασπώντας το με δύο τρόπους: μη ομόλογη ένωση άκρων (NHEJ) και επισκευή κατευθυνόμενη από ομολογία (HDR). Η NHEJ επισκευάζει το δίκλωνο DNA απουσία ξένου ομόλογου DNA μέσω μιας ενζυματικής διαδικασίας, ενός μηχανισμού επιρρεπούς σε σφάλματα που μπορεί να εισάγει ή να αφαιρέσει τυχαίες αλληλουχίες DNA. Η HDR είναι πολύ ειδική και απαιτεί ομόλογα πρότυπα DNA.
Οι οδοί επιδιόρθωσης που διαμεσολαβούνται από το CRISPR/Cas9 περιλαμβάνουν μηχανισμούς μη ομόλογης σύνδεσης άκρων (NHEJ) και μηχανισμούς επιδιόρθωσης κατευθυνόμενης από ομολογία (HDR). Το NHEJ είναι μια οδός επιρρεπής σε σφάλματα επειδή περιλαμβάνει εισαγωγή ή διαγραφή και δεν απαιτεί κανένα μοτίβο κατά τη διάρκεια του μηχανισμού επιδιόρθωσης. Χρησιμοποιεί τυχαία νουκλεοτίδια για τη δημιουργία πρότυπων πρωτεϊνών (Abbasi et al., 2021). Αυτό το σύστημα επιδιόρθωσης αποτελείται από τέσσερα σύμπλοκα όπως το σύμπλοκο KU, το σύμπλοκο διασταυρούμενης συμπληρωματικής πρωτεΐνης τύπου 4 (XRCC-4), το ένζυμο επεξεργασίας άκρων DNA και την πρωτεϊνική κινάση DNA-PKcs (Abbasi et al., 2021). Η πρωτεΐνη του συμπλόκου KU έχει δύο υπομονάδες, την Ku 70 και την Ku 80, και παίζει σημαντικό ρόλο στον μηχανισμό NHEJ, καθώς ο μηχανισμός επιδιόρθωσης ξεκινά με τη σύνδεση δύο υπομονάδων (Ku 70 και Ku 80) στα αμβλέα ή σχεδόν αμβλέα άκρα του DNA-στόχου (Abbasi et al., 2021), χρησιμεύοντας ως ικρίωμα για την προσέλκυση άλλων παραγόντων που σχετίζονται με το NHEJ στο σημείο της βλάβης (Yang et al., 2020). Η XRCC-4 και η DNA λιγάση αποτελούνται από 334 και 911 αμινοξέα, αντίστοιχα, και το σύμπλεγμα XRCC4-DNA λιγάσης IV διεγείρει την απολίνωση των άκρων του DNA (Chatterjee et al., 2015). Το ένζυμο επεξεργασίας των άκρων του DNA, γνωστό και ως 3'-φωσφορική πολυνουκλεοτιδική κινάση, είναι ένα ένζυμο επεξεργασίας των άκρων του DNA. Μπορεί να αφαιρέσει την ομάδα 3'P στο DNA και να φωσφορυλιώσει την ομάδα 5'OH κατά την επιδιόρθωση του DSB. Περιλαμβάνει επίσης την επιδιόρθωση μονοκλωνικών θραυσμάτων (SSBs) χρησιμοποιώντας την οδό επιδιόρθωσης SSB (Chatterjee et al., 2015). Η πρωτεϊνική κινάση DNA-PKcs είναι μια DNA-εξαρτώμενη πρωτεϊνική κινάση που αποτελείται από μια καταλυτική υπομονάδα της οικογένειας PIKKs (κινάσες σχετιζόμενες με φωσφατιδυλινοσιτόλη 3-κινάση) και μεταλλαγμένης αταξίας-τελαγγειεκτασίας (ATM), καθώς και ATRs σχετιζόμενα με ATM και Rad3, θραύσματα αλυσίδας (DSBs) και θραύσματα μονής αλυσίδας (Yue et al., 2020; Peng et al., 2016).
Η HDR είναι ένας πιο ακριβής και κατάλληλος μηχανισμός επιδιόρθωσης επειδή οι πληροφορίες αντιγράφονται χρησιμοποιώντας την άθικτη μορφή του ομόλογου διπλού DNA, αν και απαιτεί την παρουσία αδελφών χρωματιδίων. Αυτό συμβαίνει κατά τη φάση S/G2 του κυτταρικού κύκλου των θηλαστικών. Η HDR εμφανίζεται κυρίως σε είδη ζύμης, αλλά η NHEJ είναι κρίσιμη στα θηλαστικά (Burma et al., 2006; Abbasi et al., 2021). Ο πλήρης μηχανισμός επιδιόρθωσης φαίνεται στο Σχήμα 1.
Δεδομένου ότι το TNBC προκαλείται από γενετικές και επιγενετικές ανωμαλίες, η διόρθωση κακοήθων γονιδιωματικών/επιγενωμικών ανωμαλιών χρησιμοποιώντας CRISPR/Cas9 μπορεί να είναι μια λογική θεραπευτική προσέγγιση (Chen et al., 2019). Επιπλέον, ορισμένοι παράγοντες μεταγραφής που εμπλέκονται στην κυτταρική ρύθμιση της μεταγραφής μπορεί να παρουσιάζουν μοναδικά χαρακτηριστικά των καρκινικών κυττάρων, γεγονός που υποδηλώνει ότι η μεταγραφική ρύθμιση μπορεί να είναι μια εξαιρετική προσέγγιση για τη θεραπεία του καρκίνου (Drost et al., 2017). Η αξιοποίηση αυτών των μοριακών χαρακτηριστικών των όγκων, όπως γενετικά, επιγενετικά και μεταγραφικά ελαττώματα, για την ανάπτυξη φαρμάκων μπορεί να βελτιώσει τα κλινικά αποτελέσματα και να μειώσει το κόστος διαλογής. Το CRISPR είναι ένα πιθανό εργαλείο επεξεργασίας γονιδίων που όχι μόνο μπορεί να ανιχνεύσει και να αναγνωρίσει γονιδιωματικούς στόχους που προκαλούν καρκίνο, αλλά μπορεί επίσης να χρησιμοποιηθεί για την επεξεργασία, την καταστολή και την επιγενετική τροποποίηση ογκογονιδίων σε ανθρώπινα κύτταρα (Πίνακας 1) (Ahmed et al., 2021). Έχουν διεξαχθεί αρκετές διαλογές CRISPR για την αναζήτηση γονιδίων που σχετίζονται με καταστολείς όγκων, ογκογονίδια και αντοχή στα φάρμακα. Η χρήση του CRISPR/Cas9 για την επεξεργασία διαφόρων ογκογονιδίων TNBC φαίνεται στο Σχήμα 2.
Σχήμα 2. Γονιδιακή επεξεργασία διαφόρων ογκογονιδίων TNBC χρησιμοποιώντας CRISPR/Cas9 με αποτέλεσμα τη μειωμένη ανάπτυξη και μετάσταση του όγκου. Αυτά τα ογκογονίδια περιλαμβάνουν τα CDK7, NAT1, UBR5, YTHDF2, ITGA9, CXCR4 και CXCR7, Crypto1, ROR1 και ST8SIA, τα οποία εμπλέκονται στην εμφάνιση και τη μετάσταση του TNBC.
Η μετανάστευση, η εισβολή και η επιθηλιο-μεσεγχυματική μετάπτωση (EMT) των καρκινικών κυττάρων σχετίζονται με την ITGA9. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι η ITGA9 είναι βασικός παράγοντας στην οδό Notch και παίζει έναν ενδιαφέροντα ρόλο στη μετάσταση του ραβδομυοσαρκώματος (Molist et al., 2020). Επιπλέον, η ITGA9 βρέθηκε να σχετίζεται στενά με την πρόγνωση των ασθενών σε διάφορους τύπους όγκων, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του μαστού (Wang Z. et al., 2019). Επιπλέον, η βιοπληροφορική ανάλυση της ITGA9 έδειξε ότι η έκφρασή της στο TNBC ήταν σημαντικά υψηλότερη από ό,τι σε άλλους υποτύπους καρκίνου του μαστού. Τα αυξημένα επίπεδα ITGA9 σχετίζονται με μετάσταση και υποτροπή του όγκου σε ασθενείς με TNBC. Η εξουδετέρωση της ITGA9 με CRISPR/Cas9 είχε ως αποτέλεσμα ιδιότητες παρόμοιες με τα καρκινικά βλαστοκύτταρα (CSC), αγγειογένεση όγκου, ανάπτυξη όγκου και μειωμένη μετάσταση προάγοντας την αποικοδόμηση της β-κατενίνης στο TNBC (Wang Z. et al., 2019).
Η Crypto-1 είναι μέλος της οικογένειας TGF-β και είναι κρίσιμη για την πρώιμη εμβρυογένεση, τη συντήρηση των βλαστοκυττάρων και τη μετάσταση του καρκίνου (Ishii et al., 2021). Γνωστή και ως Tdgf-1, είναι μια ογκογόνος πρωτεΐνη σηματοδότησης αγκυρωμένη στην GPI που εμπλέκεται στη ρύθμιση του σχηματισμού της πρωτόγονης ράβδωσης, του μεσοδέρματος και του ενδοδέρματος, καθώς και στην εγκαθίδρυση ασυμμετρίας αριστεράς/δεξιάς στην ανάπτυξη των οργάνων του σώματος κατά την εμβρυογένεση (Zhang et al., 2021b). Επιπλέον, έχει αποδειχθεί ότι η Cripto-1 εμπλέκεται στην επιθηλιακή-μεσεγχυματική μετάβαση (EMT) ως δείκτης βλαστοκυττάρων (Zhang et al., 2021b). Η EMT είναι κρίσιμη όχι μόνο για διάφορες διεργασίες όπως η εμβρυϊκή ανάπτυξη, η ίνωση και η επούλωση τραυμάτων, αλλά και για την εισβολή και τη μετάσταση του καρκίνου. Επιπλέον, έχει αποδειχθεί ότι η Cripto-1 αλληλεπιδρά με τέσσερις υποδοχείς Notch και ενισχύει την μετα-μεταφραστική τους ωρίμανση (Brandstadter και Maillard, 2019). Η οδός σηματοδότησης Notch είναι γνωστό ότι εμπλέκεται στη διατήρηση των ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων του μαστού. Μελέτες έχουν δείξει ότι η εξουδετέρωση του Crypto-1 μέσω CRISPR/Cas9 καταστέλλει την ανάπτυξη και τη μετάσταση του καρκίνου. Επομένως, το Crypto-1 μπορεί να γίνει ένας σημαντικός θεραπευτικός στόχος για το TNBC (Castro et al., 2015).
Η πρωτεΐνη XCL12 και ο υποδοχέας χημειοκίνης CXC (CXCR4 και CXCR7) παίζουν διάφορους ρόλους στον πολλαπλασιασμό, την ανάπτυξη, τη μετανάστευση και την εισβολή των καρκινικών κυττάρων (Wu et al., 2015). Αυτοί οι χημειοϋποδοχείς έχουν συσχετιστεί με την ανάπτυξη του TNBC μέσω πολλαπλών σηματοδοτικών οδών τόσο σε in vivo όσο και σε in vitro μοντέλα (Wu et al., 2015). Επιπλέον, η ενεργοποίηση των CXCR4 και CXCR7 σχετίζεται με μεγαλύτερη ευαισθησία στη μετάσταση και κακή πρόγνωση στον TNBC (Karn et al., 2022). Επομένως, η εξουδετέρωση των CXCR4 και CXCR7 μπορεί να γίνει αποτελεσματικά γονίδια-στόχοι φαρμάκων για τη θεραπεία του καρκίνου του μαστού, συμπεριλαμβανομένου του TNBC. Μελέτη των Yang et al. Οι Yang et al (2019) χρησιμοποίησαν το CRISPR/Cas9 για να εξουδετερώσουν ταυτόχρονα τα γονίδια CXCR4 και CXCR7 και διαπίστωσαν ότι ο πολλαπλασιασμός, η ανάπτυξη, η μετανάστευση και η εισβολή των TNBC αναστέλλονταν σημαντικά (Yang et al., 2019).
Αυξημένα επίπεδα του miR-3662, ενός ογκογονιδίου TNBC, παρατηρήθηκαν σε ιστούς καρκίνου του μαστού (Yi et al., 2022). Η καταστολή του miR-3662 έχει αποδειχθεί ότι αναστέλλει την ανάπτυξη και τη μετάσταση του όγκου του καρκίνου του μαστού τόσο in vivo όσο και in vitro (Agarwal and Gupta, 2021). Το HBP-1 είναι ένας ισχυρός αναστολέας της σηματοδότησης Wnt/-κατενίνης και είναι πιθανώς υπεύθυνο για την ανάπτυξη των κυττάρων TNBC που προκαλείται από το miR-3662. Πρόσφατα, οι Yi et al. διαπίστωσαν ότι ο άξονας miR-3662-HBP1 ρυθμίζει την οδό σηματοδότησης Wnt/-κατενίνης στα κύτταρα TNBC (Yi et al., 2022). Λόγω της ειδικής για τον όγκο έκφρασής του, το miR-3662 μπορεί να αποτελέσει έναν πιθανό θεραπευτικό στόχο για το TNBC. Έτσι, η καταστολή του miR-3662 που προκαλείται από το CRISPR/Cas9 μπορεί να είναι μια εξαιρετική προσέγγιση για την ανάπτυξη νέων φαρμάκων για τη θεραπεία του TNBC.
Η UBR5 είναι μια νουκλεοφωσφοπρωτεΐνη 300 kDa που έχει αναγνωριστεί ως βασικός ρυθμιστής της καρκινογένεσης, της μετάστασης και της ανοσολογικής απόκρισης σε διάφορους καρκίνους (Shearer et al., 2015; Fu et al., 2023). Έχει αναφερθεί ότι η UBR5 είναι ιδιαίτερα ανοδική σε δείγματα TNBC και διεγείρει τη λειτουργία του ERα προκαλώντας πολλαπλασιασμό μέσω της δράσης της λιγάσης ουβικιτίνης (Bolt et al., 2015). Μελέτες αλληλούχισης ολόκληρου του εξονίου σε πρωτογενή δείγματα TNBC έδειξαν επίσης αυξημένη έκφραση της UBR5, υποδηλώνοντας τον ρόλο της στην ανάπτυξη του TNBC. Επιπλέον, η διαγραφή της UBR5 που προκαλείται από την CRISPR/Cas9 έδειξε σημαντική αναστολή της μετάστασης και της ανάπτυξης των TNBC σε πειραματικά μοντέλα ποντικών. Επιπλέον, η συμπερίληψη της UBR5 σε ένα μοντέλο ποντικού άγριου τύπου αποκατέστησε την πλήρη λειτουργικότητά της, ενώ αυτό το αποτέλεσμα δεν παρατηρήθηκε σε αδρανοποιημένα μεταλλαγμένα στελέχη (Liao et al., 2017). Η έλλειψη UBR5 σχετίζεται με αυξημένη απόπτωση, νέκρωση και αναστολή της ανάπτυξης του όγκου στο TNBC λόγω κακής αγγειογένεσης. Λόγω της απώλειας του UBR5, η εξάπλωση του όγκου σε απομακρυσμένα όργανα μειώνεται και το UBR5 προκαλεί μη φυσιολογική EMT κυρίως μειώνοντας την έκφραση της Ε-καδερίνης (Zhang and Weinberg, 2018). Πρόσφατα, το UBR5 αποδείχθηκε ότι είναι ένας πολύ σημαντικός παράγοντας στην επαγόμενη από IFN-γ μεταγραφή PDL1 στο TNBC λόγω της έλλειψης δραστικότητας ουβικιτινίωσης E3. Η ανάλυση του μεταγραφώματος RNA αποκάλυψε ότι το UBR5 μπορεί να έχει συστηματικές επιδράσεις σε γονίδια που σχετίζονται με την οδό IFN-γ και να προάγει την μετενεργοποίηση του PDL1 αυξάνοντας τα επίπεδα ενεργοποίησης του RNA πρωτεϊνικής κινάσης (PKR) και των μετατροπέων και ενεργοποιητών σήματος του, της μεταγραφής 1 (STAT1) και του ρυθμιστικού παράγοντα 1 ιντερφερόνης (IRF1). Ωστόσο, η συνδυασμένη αφαίρεση της έκφρασης UBR5 και PD-L1 που προκαλείται από την CRISPR/Cas9 έχει συνεργιστική θεραπευτική δράση από ό,τι ο αποκλεισμός μόνος του, με έντονες επιπτώσεις στο μικροπεριβάλλον του όγκου (Wu et al., 2022). Έτσι, η CRISPR/Cas9 μπορεί να είναι ένα σημαντικό εργαλείο για την αναστολή της λειτουργίας του UBR5, καταστέλλοντας έτσι τη μετάσταση του TNBC και την ανάπτυξη του όγκου.
Η ROR1 είναι μια διαμεμβρανική πρωτεΐνη τύπου Ι που εκφράζεται κατά τη διάρκεια του καρκίνου και της εμβρυϊκής ανάπτυξης και έχει αναγνωριστεί ως ογκοεμβρυϊκή πρωτεΐνη (Nicholas Borcherding, 2014). Η διεισδυτική συμπεριφορά διαφόρων ανθρώπινων καρκίνων σχετίζεται με την ανοδική ρύθμιση της ROR1. Πολλά υποσχόμενα αποτελέσματα έχουν ληφθεί από μελέτες in vivo και in vitro που περιλαμβάνουν θεραπευτικές ενώσεις που στοχεύουν την ROR1 (Chien et al., 2016). Αυξημένα επίπεδα mRNA ROR1 σε βιοψίες ιστού μαστού έχουν επίσης συσχετιστεί με επιθετικούς βασικοειδείς όγκους μαστού (BL) και τη μετανάστευσή τους σε άλλα μέρη του σώματος. Επιπλέον, η υπερέκφραση της ROR1 έχει αναγνωριστεί ως προγνωστικός δείκτης για την ανάπτυξη TNBC (Chien et al., 2016). Ωστόσο, η σίγηση της ROR1 χρησιμοποιώντας CRISPR/Cas9 για την καταστολή της ανάπτυξης και της μετάστασης των TNBC θα ήταν μια αποτελεσματική στρατηγική.
Η διαδικασία σιαλυλίωσης περιλαμβάνει την προσθήκη σιαλικού οξέος σε γλυκοσυζεύγματα, η οποία καταλύεται από σιαλυλτρανσφεράσες (STs). Η ST8SIA1 ανήκει στην οικογένεια ST και παίζει σημαντικό ρόλο στην παθογένεση διαφόρων ασθενειών όπως η λεμφοκυτταρική λευχαιμία και ο καρκίνος του παχέος εντέρου (Chang et al., 2018). Η ανάλυση αλληλουχίας RNA δείχνει ότι η ST8SIA1 εκφράζεται σε υψηλό βαθμό στον ιστό του μαστού ασθενών με TNBC και συσχετίζεται θετικά με μεταλλάξεις στο γονίδιο καταστολής όγκων p53, το οποίο μπορεί να συμβάλλει στην παθογένεση της TNBC (Battula et al., 2017). Επιπλέον, η ST8SIA1 εμπλέκεται στη μετάσταση και την υποτροπή της TNBC, υποδηλώνοντας ότι παίζει σημαντικό ρόλο στην εμφάνιση και ανάπτυξη της TNBC. Σε ένα in vitro μοντέλο TNBC, η καταστολή της ST8SIA1 από το CRIPSR/Cas9 αποδείχθηκε ότι μπλοκάρει την ανάπτυξη και τη μετάσταση (Battula et al., 2017). Αυτό υποδηλώνει ότι το CRISPR/Cas9 μπορεί να είναι ένα σημαντικό εργαλείο για την αναστολή της λειτουργίας του ογκογονιδίου ST8SIA1 στη θεραπεία του TNBC.
Το NAT1 είναι ένα μεταβολικό ένζυμο που καταλύει τον σχηματισμό ξενοβιοτικών ενώσεων φάσης II και εκφράζεται σε σχεδόν όλους τους ανθρώπινους ιστούς. Το NAT1 μπορεί να χρησιμοποιήσει τον συμπαράγοντα φολικό οξύ για να στοχεύσει το ακετυλο-CoA (ακετυλο-CoA) ακόμη και απουσία του αρωματικού υποστρώματος αμίνης (Stepp et al., 2015; Laurieri et al., 2014). Μελέτες έχουν δείξει ότι το NAT1 ρυθμίζει τη λειτουργία της μεταλλοπρωτεϊνάσης μήτρας 9 (MMP9) σε μοντέλα κυττάρων καρκίνου του μαστού και προστατεύει από τα αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS) κατά τη διάρκεια της έλλειψης γλυκόζης (Wang et al., 2018). Η διαγραφή του NAT1 έχει αποδειχθεί ότι αναστέλλει το σύμπλεγμα πυροσταφυλικής αφυδρογονάσης, οδηγώντας σε μιτοχονδριακή δυσλειτουργία (Wang L. et al., 2019). Επιπλέον, διάφορες άλλες αναφορές έχουν δείξει ότι η αναστολή του NAT1 χρησιμοποιώντας μικρά μόρια και σίγηση siRNA μπορεί να μειώσει την διεισδυτικότητα και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων καρκίνου του μαστού (Stepp et al., 2018). Πρόσφατα, το CRISPR/Cas9 χρησιμοποιήθηκε για την καταστολή του NAT1 στην κυτταρική σειρά καρκίνου του μαστού MDA-MB-231, επηρεάζοντας τον κυτταρικό μεταβολισμό ανάλογα με το επίπεδο έκφρασής του. Αυτή η μελέτη έδειξε επίσης ότι το NAT-1 είναι κρίσιμο για την εξέλιξη και τη μετάσταση του TNBC (Carlisle et al., 2020).
Η συντονισμένη μεταγραφή των ογκογονιδίων ρυθμίζεται από υπερενισχυτές, παράγοντες μεταγραφής και συμπαράγοντες (Hnisz et al., 2015). Επιπλέον, μια ομάδα κυκλινοεξαρτώμενων κινασών (CDKs), όπως οι CDK7, CDK8, CDK9, CDK12 και CDK13, απαιτούνται για τη μεταγραφική ρύθμιση. Μεταξύ αυτών, η CDK7 εμπλέκεται στη φωσφορυλίωση της RNA πολυμεράσης II, η οποία είναι πολύ σημαντική για την έναρξη και την επέκταση της μεταγραφής των ογκογονιδίων στην παθογένεση του TNBC. Σε μια πρωτοποριακή μελέτη, η διαγραφή της CDK7 από το CRISPR/Cas9 ανέστειλε το TNBC, υποδεικνύοντας ότι η παθογένεση του TNBC εξαρτάται από το CDK7 (Wang Y. et al., 2015).
Μελέτες έχουν δείξει ότι οι μεταλλάξεις στην MYC και την RBP (πρωτεΐνη δέσμευσης RNA) μπορούν να οδηγήσουν σε απόπτωση, ενώ οι μεταλλάξεις ενός μόνο γονιδίου στην MYC ή την RBP δεν επηρεάζουν την ανάπτυξη καρκινικών κυττάρων (Einstein et al., 2021). Περισσότερες από 1000 RBPs στο ανθρώπινο γονιδίωμα έχουν εξεταστεί χρησιμοποιώντας μια βιβλιοθήκη βασισμένη στο CRISPR/Cas9. Μεταξύ αυτών, 57 RBPs βρέθηκαν κρίσιμες για την ανάπτυξη καρκινικών κυττάρων με υψηλά επίπεδα MYC (Wheeler et al., 2020). Επιπλέον, το YTHDF2 είναι σημαντικό για τη διατήρηση της ανάπτυξης των κυττάρων TNBC και μειώνει την ποσότητα των μεθυλιωμένων μεταγράφων κατά τη διάρκεια της μεταγραφής και μετάφρασης υψηλού επιπέδου σε καρκινικά κύτταρα με υψηλότερη έκφραση MYC. Επιπλέον, το YTHDF2 δεν είναι απαραίτητο για τα καρκινικά κύτταρα, τα οποία εξαρτώνται λιγότερο από τα αυξημένα επίπεδα MYC για την παράταση της επιβίωσης των ασθενών με TNBC (Einstein et al., 2021), υποδηλώνοντας ότι μπορεί να είναι ένας πιθανός θεραπευτικός στόχος για φάρμακα που μπορούν να ξεπεράσουν το TNBC.
Οι πρωτεΐνες δακτύλου ψευδαργύρου (ZNFs) αποτελούν περίπου το 1% του συνολικού ανθρώπινου γονιδιώματος. Μελέτες έχουν δείξει ότι το ZNF μπορεί να ρυθμίσει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε διάφορους καρκίνους, όπως ο καρκίνος του ήπατος, ο καρκίνος του μαστού και ο καρκίνος του παχέος εντέρου (Zhang W. et al., 2021; Li et al., 2017). Οι βιβλιοθήκες που δημιουργούνται με CRISPR knockout έχουν χρησιμοποιηθεί για τον έλεγχο διαφόρων γονιδίων καταστολής όγκων (TSGs) σε κύτταρα καρκίνου του μαστού (Shalem et al., 2014). Έκτοτε, μια μεταγραφική μελέτη κυττάρων καρκίνου του μαστού με διαγραφή ZNF319 από CRISPR/Cas9 έδειξε ότι το ZNF319 είναι ένα γονίδιο καταστολής όγκων που μειώνει τον πολλαπλασιασμό του καρκίνου του μαστού και ως εκ τούτου εμπλέκεται σε διάφορους πιθανούς μηχανισμούς σηματοδότησης και άλλες βιολογικές λειτουργίες (Wang L. et al., 2022).
Η σιδηρόπτωση είναι ένας τύπος προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου που εξαρτάται από την παρουσία σιδήρου. Είναι γνωστό ότι η ανάπτυξη της σιδηρόπτωσης επηρεάζεται από την παρουσία υπεροξειδίων λιπιδίων. Επιπλέον, έχει αναφερθεί ότι η PKCβII εμφανίζει πρώιμη υπεροξείδωση λιπιδίων και η αυξημένη υπεροξείδωση λιπιδίων σχετίζεται με τη σιδηρόπτωση. Η διαλογή μιας βιβλιοθήκης αναστολέων κινάσης που προκαλούνται από CRISPR/Cas9 αποκάλυψε ότι η PKCβII εμπλέκεται στη διαδικασία της υπεροξείδωσης λιπιδίων, η οποία είναι κρίσιμη για τη σιδηρόπτωση σε κύτταρα MDA-MB-231 (Zhang et al., 2022). Επομένως, αυτό υποδηλώνει ότι η εξουδετέρωση της PKCβII από το CRISPR/Cas9 μπορεί να είναι ένας πιθανός στόχος γονιδίου καταστολής όγκων για τη θεραπεία ασθενειών που σχετίζονται με τη σιδηρόπτωση (Zhang et al., 2022).
Η αντοχή στα φάρμακα πιστεύεται ότι ευθύνεται για περίπου το 90% των θανάτων σε ασθενείς με καρκίνο και αποτελεί μία από τις σημαντικότερες προκλήσεις στη θεραπεία του καρκίνου (Bukowski et al., 2020). Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι ένας επαρκής αριθμός γονιδίων που σχετίζονται με την εκροή φαρμάκων, την επιδιόρθωση του DNA, την απόπτωση και διάφορες οδούς κυτταρικής σηματοδότησης σχετίζονται με την αντοχή στα φάρμακα (Haider et al., 2020). Μεταξύ αυτών, πολλά γονίδια έχουν στοχευτεί από εργαλεία CRISPR/Cas9 και έχουν δείξει πολλά υποσχόμενα αποτελέσματα στη μείωση της αντοχής στα φάρμακα και στην αύξηση της αποτελεσματικότητας των αντικαρκινικών θεραπειών (Vaghari-Tabari et al., 2022). Επιπλέον, οι βιβλιοθήκες υψηλής απόδοσης διαλογής γονιδίων CRISPR/Cas9 έχουν εμπλακεί στην τροποποίηση της λειτουργίας πιθανών γονιδίων-στόχων αντοχής στα φάρμακα (Shalem et al., 2015). Για την ταυτοποίηση γονιδίων αντοχής στην πακλιταξέλη, χρησιμοποιήθηκε αλληλούχιση RNA σε συνδυασμό με διαλογή βιβλιοθήκης sgRNA σε ολόκληρο το γονιδίωμα για την ταυτοποίηση οκτώ υποψήφιων γονιδίων, συμπεριλαμβανομένης της ιστονικής δεακετυλάσης 9 (HDAC9), που σχετίζονται με την αντοχή στα φάρμακα σε ασθενείς με υποτροπιάζον TNBC (B et al., 2020). Σε μια άλλη μελέτη, παρατηρήθηκε αυξημένη έκφραση της δισερίνης/θρεονίνης και της τυροσινικής πρωτεϊνικής κινάσης (DSTYK) κατά την επιβίωση ασθενών με TNBC που έλαβαν αντικαρκινικά φάρμακα. Επιπλέον, η καταστολή της DSTYK με τη μεσολάβηση CRISPR/Cas9 ενίσχυσε σημαντικά την απόπτωση των ανθεκτικών στα φάρμακα καρκινικών κυττάρων in vitro (κύτταρα SUM102PT και κύτταρα MDA-MB-468) και σε ένα in vivo μοντέλο TNBC (Ogbu et al., 2021).
Παρόλο που το TNBC έχει ανώμαλη ενεργοποίηση της οδού MAPK, το κλινικό αποτέλεσμα των θεραπειών που στοχεύουν σε MEK είναι πενιχρό. Μια διαλογή γονιδιωματικής βιβλιοθήκης CRISPR/Cas9 αποκάλυψε ότι η αναστολή της PSMG2 (συνοδός 2 της συναρμολόγησης πρωτεόματος) ευαισθητοποιεί τα κύτταρα TNBC BT549 και MB468 στον αναστολέα MEK AZD6244. Η καταστολή CRISPR/Cas9 της PSMG2 άλλαξε την φυσιολογική λειτουργία του πρωτεασώματος, οδηγώντας σε αποσυναρμολόγηση της PDPK1 που προκαλείται από την αυτοφαγία, βελτιώνοντας έτσι περαιτέρω τα καρκινικά κύτταρα σε μοντέλα ποντικών TNBC που επάγονται από AZD6244 (αναστολέας MEK) και MG132 (αναστολέας πρωτεασώματος). Έτσι, οι αναστολείς πρωτεασώματος και κινάσης MAP (MEK) μπορούν να χορηγηθούν συνεργιστικά για τη μείωση του πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων (Wang X. et al., 2022).
Το CRISPR/Cas9 έχει επίσης χρησιμοποιηθεί για τον έλεγχο της απώλειας της γονιδιακής λειτουργίας που οδηγεί σε αντοχή στο TNBC (Shu et al., 2020). Οι Ge et al. εξήγησαν τον μηχανισμό αντοχής στα φάρμακα των καρκινικών κυττάρων που έλαβαν θεραπεία με JQ1, έναν αναστολέα βρωμοδεαμίνης BET (BBDI), στο TNBC. Χρησιμοποιώντας το CRISPR/Cas9, διαπίστωσαν ότι η διαγραφή του γονιδίου rb1 προκάλεσε την ανθεκτικότητα του TNBC στο αντικαρκινικό φάρμακο JQ1. Επομένως, η λειτουργία του rb1 είναι σημαντική στην απόκριση στα φάρμακα JQ1 στο TNBC. Ανέφεραν επίσης ότι η πακλιταξέλη είναι ένας αναστολέας κινάσης/μικροσωληνίσκων CDK4/6 και ο συνδυασμός της με BBDI όπως το JQ1 μπορεί να παρέχει πολλά υποσχόμενες θεραπευτικές αποκρίσεις στο ανθεκτικό στα φάρμακα TNBC (Ge et al., 2020).
Το μεταγραφικό τοπίο του μακρού μη κωδικοποιητικού RNA (lncRNA) έχει αναφερθεί ότι ευθύνεται για την αντοχή στη νεοεπικουρική θεραπεία στο TNBC. Αυτή η μελέτη δείχνει ότι πέντε διαφορετικά αντίγραφα MALAT1 lncRNA εκφράζονται σε υψηλό βαθμό στο TNBC. Επιπλέον, η διαγραφή του MALAT1 που προκαλείται από CRISPR/Cas9 αύξησε την ευαισθησία των κυττάρων BT-549 του TNBC στην πακλιταξέλη και τη δοξορουβικίνη, υποδηλώνοντας έναν πιθανό ρόλο για την αντοχή στο MALAT1 στο TNBC (Shaath et al., 2021).
Οι μεταλλάξεις στο BRCA1 (BRCA1m) είναι ετερογενείς και επομένως δύσκολο να ανιχνευθούν. Η στόχευση της PARP1 (πολυ(ADP-ριβόζη) πολυμεράση), του συνθετικού θανατηφόρου συνεργάτη του BRCA1, μπορεί να αυξήσει τη χημειοευαισθησία στα φάρμακα του TNBC. Χρησιμοποιώντας CRISPR/Cas9, η διαγραφή της PARP1 αύξησε την ευαισθησία των αντικαρκινικών φαρμάκων όπως η δοξορουβικίνη, η γεμσιταβίνη και η δοκεταξέλη στα μεταλλαγμένα κύτταρα TNBC mBRCA1, υποδηλώνοντας ότι η PARP1 εμπλέκεται επίσης στην αντοχή στα φάρμακα στο TNBC (Vaghari-Tabari et al., 2022). Οι μεταλλάξεις στα γονίδια καταστολής όγκων BRCA1 ή BRCA2 είναι γνωστό ότι αυξάνουν την πιθανότητα εμφάνισης καρκίνου του μαστού στους ανθρώπους. Η θεραπεία αυτών των ασθενών απαιτεί τη χρήση αναστολέων PARP. Επιπλέον, έχει αποδειχθεί ότι η εξάλειψη του παράγοντα διάσωσης νουκλεοτιδίων DNPH1 χρησιμοποιώντας CRISPR/Cas9 μπορεί να απομακρύνει το τοξικό μονοφωσφορικό νουκλεοτίδιο 5-υδροξυμεθυλοδεοξυουριδίνη (hmdU), ενισχύοντας έτσι την απόκριση των κυττάρων με έλλειψη BRCA στην ευαισθησία στους αναστολείς PARP (Fugger). et al., 2021). Έτσι, οι αναστολείς CRISPR/Cas9 και PARP1 μπορούν να αποτελέσουν μια σημαντική στρατηγική θεραπείας για το TNBC.
Το γονίδιο της διεισδυτικής γλυκοπρωτεΐνης (P-gp) είναι ένα γονίδιο αντοχής σε πολλαπλά φάρμακα που γενικά εκφράζεται προς τα πάνω σε περίπου 41% όλων των TNBC (Sun et al., 2020). Η εκροή φαρμάκων που προκαλείται από την P-gp έχει αναγνωριστεί ως βασικός ρυθμιστής της αντοχής στα φάρμακα στον καρκίνο του μαστού. Οι αναστολείς της P-gp έχουν δείξει αυξημένη ευαισθησία στα αντικαρκινικά φάρμακα στον καρκίνο του μαστού (Famta et al., 2021). Έτσι, η αφαίρεση ή η καταστολή της P-gp και των αναστολέων της P-gp που προκαλείται από CRISPR/Cas9 μπορεί να είναι πολύ σημαντικές μέθοδοι για την υπερνίκηση της αντοχής στα φάρμακα στον TNBC.
Ο μεταφορέας κασέτας δέσμευσης ATP G2 (ABCG2) είναι γνωστό ότι προκαλεί αντοχή στα φάρμακα στο TNBC (Palasuberniam et al., 2015), αν και προς το παρόν δεν υπάρχουν αναφορές σχετικά με τη σχέση μεταξύ της σίγασης CRISPR/Cas9 και του ABCG2 και της απενεργοποίησης του γονιδίου καταστολής όγκων. Το PTEN μπορεί να ενισχύσει την ενεργοποίηση του ABCG2 (Palasuberniam et al., 2015), (Deepak Singh et al., 2021). Επομένως, η χρήση CRISP/Ca9 για την απομάκρυνση του ABCG2 και ο συνδυασμός του με έναν αναστολέα ABCG2 μπορεί να είναι μια κατάλληλη θεραπεία για την υπερνίκηση της αντοχής στα φάρμακα στο TNBC. Ο Πίνακας 2 αναφέρει ότι το CRISPR/Cas9 στοχεύει όλα τα γονίδια αντοχής.
Πίνακας 2. Το CRISPR/Cas9 στοχεύει διάφορα γονίδια αντοχής στο TNBC για την ευαισθητοποίηση των κυττάρων σε αντικαρκινικά φάρμακα.
Οι βιβλιοθήκες CRISPR/Cas9 αποτελούν πιθανά εργαλεία για τον έλεγχο γονιδιακών μεταλλάξεων που σχετίζονται με την παθογένεση του καρκίνου (Chan et al., 2022). Αυτή η μέθοδος ελέγχου περιλαμβάνει τέσσερα βήματα, όπως (α) κατασκευή βιβλιοθήκης, (β) μεταγωγή λεντιϊού, (γ) φαινοτυπική εξέταση και (δ) ανάλυση γονιδίου-στόχου. Παρόλο που το TNBC έχει ανώμαλη ενεργοποίηση της οδού MAPK, η κλινική πρόγνωση της στοχευμένης θεραπείας MEK για ασθενείς με TNBC που φέρουν μεταλλάξεις σε γονίδια καταστολής όγκων όπως τα PTEN, RB1 και TP53 είναι πολύ κακή.
Επιπλέον, μια διαλογή γονιδίων με χρήση CRISPR/Cas9 εξέτασε το πιο ισχυρό και επιλεκτικό μόριο, την δεϋδροκατρόλη, η οποία βρίσκεται σε αφθονία στα εκχυλίσματα λουλουδιών και φύλλων της Γουατεμάλας, για να κατανοηθεί η επίδραση της δεϋδροκατρόλης στο MDA-MB-231. Μηχανισμοί επιλεκτικής κυτταροτοξικότητας κυττάρων. Χαρακτηριστικά μεσεγχυματικού στελέχους υποτύπων TNBC. Αυτή η διαλογή που βασίζεται στο CRISPR/Cas9 αποκάλυψε επίσης ότι το HSD17B11, ένα γονίδιο που κωδικοποιεί την 17β-υδροξυστεροειδή αφυδρογονάση τύπου 11, εκφράζεται σε υψηλά επίπεδα σε κύτταρα MDA-MB-231 και έχει ως αποτέλεσμα την παραγωγή δεϋδροφαλκαρινόλης ειδικής για τα κύτταρα MDA-MB-231 (Grant et. al., 2020). Επομένως, αυτό υποδηλώνει ότι ο γονιδιωματικός έλεγχος CRISPR/Cas9 έχει μεγάλο δυναμικό στην αναγνώριση των μηχανισμών που διέπουν τις αντικαρκινικές ιδιότητες πιθανών φυσικών ενώσεων.
Επιπλέον, η ευπάθεια του TNBC στον καρκίνο μελετήθηκε χρησιμοποιώντας μια αμερόληπτη διαλογή CRISPR/Cas9 σε ολόκληρο το γονιδίωμα, η οποία έδειξε μια σύνδεση μεταξύ ογκογονικών και κατασταλτικών οδών όγκων. Βασικά συστατικά των οδών mTOR και Hippo έχουν αναφερθεί ότι παίζουν σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση του όγκου στο TNBC. Επιπλέον, μελέτες έχουν δείξει ότι η φαρμακολογική αναστολή της mTORC1/2 και της ογκοπρωτεΐνης YAP αναστέλλει αποτελεσματικά την παθογένεια του TNBC χρησιμοποιώντας ένα μοντέλο συνέργειας φαρμάκου-μήτρας in vitro και ξενομοσχεύματα που προέρχονται από ασθενείς in vivo. Επιπλέον, η αναστολή της mTORC1/2 που προκαλείται από την Torin-1 ενισχύει τη μακροπινοκυττάρωση, ενώ η αναστολή της YAP που προκαλείται από τη βερτεπορφίνη οδηγεί σε κυτταρικό θάνατο του TNBC. Συνολικά, αυτά τα αποτελέσματα υπογραμμίζουν τη δύναμη και την ανθεκτικότητα της διαλογής CRISPR in vivo σε ολόκληρο το γονιδίωμα για τον εντοπισμό νέων και αποτελεσματικών θεραπειών για το TNBC (Dai et al., 2021).
Η δυσλειτουργία του ανοσοποιητικού συστήματος είναι ένας σημαντικός παράγοντας στην καρκινογένεση. Τα καρκινικά κύτταρα αποφεύγουν την ανοσοκάθαρση παρακάμπτοντας τους αμυντικούς μηχανισμούς, συμπεριλαμβανομένης της παρέμβασης στη δραστηριότητα των ανοσοκυττάρων στο μικροπεριβάλλον του όγκου και της θέτοντας σε κίνδυνο το ανοσοποιητικό σύστημα. Επομένως, η ανάπτυξη ενός βελτιωμένου ανοσοποιητικού συστήματος μπορεί να αποτελέσει μια βασική προσέγγιση για την καταπολέμηση των όγκων. Η χρήση τροποποίησης γονιδίων που βασίζεται στο CRISPR/Cas9 αντιμετωπίζει διάφορα ζητήματα που σχετίζονται με την ανοσολογική δυσλειτουργία από διαφορετικές οπτικές γωνίες. Το CRISPR/Cas9 έχει χρησιμοποιηθεί για τη βελτίωση της αντικαρκινικής ανοσίας κατά του καρκίνου του μαστού μέσω των ακόλουθων οδών (Σχήμα 3).
Σχήμα 3. Η ανοσοθεραπεία CRISPR/Cas9 στοχεύει τα κύτταρα TNBC. Η απώλεια του CDK5 και η καταστολή των PDL1 και CD155 ενισχύουν το ανοσοποιητικό σύστημα. Ομοίως, η απώλεια του A2AR και η καταστολή των TAA όπως το HER2, η βλεννίνη 1 και το TEM8 αύξησαν την αποτελεσματικότητα των κυττάρων CAR-T στην εξόντωση των καρκινικών κυττάρων. Ο έλεγχος Τ κυττάρων που καθοδηγείται από το CRISPR/Cas9 έδειξε ότι η διαταραχή της κινάσης p38 ενισχύει την αντικαρκινική δράση των Τ κυττάρων. Τα Τ κύτταρα που τροποποιούνται από το CRISPR/Cas9 αυξάνουν την έκφραση του TCR (υποδοχέας Τ κυττάρων), με αποτέλεσμα τα Τ κύτταρα να έχουν αντικαρκινική δράση.
Στόχος της ανοσοθεραπείας είναι η διέγερση του ανοσοποιητικού συστήματος ώστε να επιτεθεί στα καρκινικά κύτταρα. Η υπερέκφραση των ανοσολογικών πρωτεϊνών σημείων ελέγχου συνήθως αποτρέπει τις αυτοάνοσες αντιδράσεις, αλλά μπορεί να βοηθήσει τους καρκίνους να τις αποφύγουν (Topalian et al., 2015). Αυτές οι πρωτεΐνες αποτρέπουν τις ανοσολογικές αντιδράσεις συνδεόμενες με υποδοχείς στην επιφάνεια των ανοσοκυττάρων. Πολλαπλές πρωτεΐνες σημείων ελέγχου (όπως η CD155 και η PD-L1) στοχεύουν τον υποδοχέα PD-1 στα ανοσοκύτταρα και εκφράζονται στον καρκίνο του μαστού, ειδικά στον καρκίνο του μαστού (TNBC) (Li Y.-C. et al., 2020). Η καταστολή του PD-L1 ή του υποδοχέα του χρησιμοποιώντας CRISPR/Cas9 μπορεί να διεγείρει το ανοσοποιητικό σύστημα ώστε να επιτεθεί σε όγκους TNBC (Yahata et al., 2019). Επιπλέον, η μείωση της έκφρασης του PD-L1 μέσω της διαγραφής του CDK5 που προκαλείται από CRISPR/Cas9 έχει αποδειχθεί ότι αναστέλλει την ανάπτυξη του όγκου in vitro και in vivo (Deng et al., 2020). Η αναστολή της ανάπτυξης σε μοντέλα καρκίνου του μαστού in vitro και in vivo υποδηλώνει ότι η μείωση του CD155 που προκαλείται από shRNA μπορεί να έχει θεραπευτική επίδραση στον καρκίνο του μαστού (Gao et al., 2018).
Τα CAR Τ κύτταρα εκφράζουν CAR που αναγνωρίζουν αντιγόνα που σχετίζονται με όγκους (TAAs) και μπορούν να χρησιμοποιήσουν την καταστολή των πρωτεϊνών ελέγχου για να ενισχύσουν τη δραστηριότητά τους (Li C. et al., 2020). Υπάρχουν διάφοροι πιθανοί στόχοι για τη θεραπεία με CAR Τ κύτταρα στον καρκίνο του μαστού, συμπεριλαμβανομένων αρκετών TAAs όπως HER2, mucin1 και TEM8 (Bajgain et al., 2018). Υπάρχουν ενδείξεις ότι τα CAR Τ κύτταρα που στοχεύουν τη μεσοθηλίνη (υπερεκφράζεται σε κύτταρα TNBC BT-459) είναι πιο αποτελεσματικά κατά του καρκίνου όταν η PD-1 εξαλείφεται χρησιμοποιώντας CRISPR/Cas9 (Hu et al., 2019). Ωστόσο, η απομόνωση των Τ κυττάρων από τους ασθενείς και στη συνέχεια η επεξεργασία τους ex vivo είναι μια διαδικασία που απαιτεί πολύ χρόνο και εργασία. Αν και τα καθολικά Τ κύτταρα μπορούν να μειώσουν τις απαιτήσεις απομόνωσης, τα Τ κύτταρα-δότες που εκφράζουν αντιγόνο ανθρώπινου λευκοκυττάρου (HLA) κατηγορίας Ι και υποδοχέα Τ κυττάρων (TCR) θα πρέπει να αφαιρούνται για την πρόληψη ανωμαλιών μοσχεύματος έναντι ξενιστή (Ren et al., 2017). , 2017a). Χρησιμοποιώντας το CRISPR/Cas9, το HDR μπορεί ταυτόχρονα να εξαλείψει το TCR και το HLA και να αποκλείσει το γονίδιο που κωδικοποιεί το CAR. Μελέτες έχουν δείξει ότι το CRISPR/Cas9 μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την εισαγωγή αντι-CD19 CAR στον τόπο του TCR, παράγοντας έτσι αποτελεσματικά CAR χωρίς να εξαντλεί τα Τ κύτταρα (Dimitri et al., 2022). Έχουν αναπτυχθεί τεχνολογίες πολλαπλής σύνδεσης για τη δημιουργία αλλογενών CAR Τ κυττάρων, εξαλείφοντας ταυτόχρονα το TCR, τη βήτα-2-μικροσφαιρίνη (B2M), την υπομονάδα HLA-I και άλλες πρωτεΐνες όπως η PD-1 και η CTLA-4, οι οποίες μπορεί να έχουν μεγαλύτερες αντικαρκινικές ιδιότητες έναντι του TNBC (Eyquem et al., 2017; Liu et al., 2017; Ren et al., 2017b; Dimitri et al., 2022).
Η χρήση του CRISPR/Cas9 θα μπορούσε να βελτιώσει την αποτελεσματικότητα των κυττάρων CAR-T. Η αδενοσίνη είναι γνωστό ότι έχει ανοσοκατασταλτικές ιδιότητες και μπορεί να μειώσει την αντικαρκινική ανοσία εμποδίζοντας τη λειτουργία των Τ κυττάρων και ενεργοποιώντας τους υποδοχείς αδενοσίνης A2A (A2AR) (Vigano et al., 2019). Η σίγηση του A2AR χρησιμοποιώντας CRISPR/Cas9 βελτίωσε σημαντικά την αποτελεσματικότητα των κυττάρων CAR-T in vivo (Giuffrida et al., 2021). Τα Τ κύτταρα είναι γνωστό ότι εμφανίζουν διάφορα φαινοτυπικά χαρακτηριστικά όπως κυτταρική επέκταση, διαφοροποίηση, οξειδωτικό στρες και γονιδιωματικό στρες. Ο έλεγχος Τ κυττάρων με βάση το CRISPR/Cas9 αποκάλυψε διαταραχή 25 διαφορετικών κινασών υποδοχέα Τ κυττάρων. Μεταξύ αυτών, η διαγραφή της κινάσης p38 έχει αποδειχθεί ότι ενισχύει την αντικαρκινική δράση των Τ κυττάρων, υποδεικνύοντας ότι η κινάση p38 είναι ένας βασικός ρυθμιστής της ρύθμισης των κυττάρων CAR-T (Gurusamy et al., 2020).
Τα Τ κύτταρα μπορούν να τροποποιηθούν γενετικά χρησιμοποιώντας CRISPR/Cas9 για να παράγουν TCR υψηλής έκφρασης. Η μεταφορά γενετικά τροποποιημένων Τ κυττάρων σε ασθενείς έχει δείξει ισχυρότερη αντικαρκινική δράση από τα ενδογενή Τ κύτταρα. Επομένως, τα ενδογενή TCR μπορεί να ανταγωνίζονται τα γενετικά τροποποιημένα TCR σε ασθενείς, γεγονός που μπορεί να επηρεάσει τις δυνατότητες της ανοσοθεραπείας του καρκίνου. Για να ξεπεραστεί αυτό το πρόβλημα, η χρήση CRISPR/Cas9 για την απομάκρυνση του ενδογενούς TCR-β από τα κύτταρα-δέκτες και στη συνέχεια τη μεταφορά TCR-β Τ κυττάρων σε ασθενείς με καρκίνο μπορεί να εμφανίσει καλύτερες αντικαρκινικές ανοσολογικές αποκρίσεις χωρίς την ανάγκη για ενδογενή σεξουαλικό ανταγωνισμό TCR (Fan et al. 2018). Έτσι, με εξαίρεση τα τροποποιημένα με CRISPR Τ κύτταρα, τα TCR είναι χίλιες φορές πιο ευαίσθητα σε αντιγόνα όγκου από τα φυσιολογικά Τ κύτταρα που έχουν μετατραπεί με TCR. Επιπλέον, σε διάφορες λευχαιμίες, τα τροποποιημένα Τ κύτταρα που παράγονται από γδ TCR+ CRISPR εμφανίζουν υψηλότερη έκφραση CD4+ και CD8+ Τ κυττάρων από την τυπική μεταφορά TCR (Legut et al., 2018). Έτσι, τα τροποποιημένα Τ κύτταρα που παράγονται από το CRISPR/Cas9 μπορεί να είναι μια αποτελεσματική μέθοδος ανοσοθεραπείας για την αντιμετώπιση του TNBC.
Οι ιντεγκρίνες είναι μόρια κυτταρικής προσκόλλησης που υπάρχουν στις κυτταρικές διαμεμβράνες και προάγουν τη σύνδεση των κυττάρων με την εξωκυτταρική μήτρα (ECM) (Hamidi και Ivaska, 2018). Η δυσλειτουργία των ιντεγκρίνων σχετίζεται με την ανάπτυξη και τη μετανάστευση του καρκίνου μεταβάλλοντας την εξωκυτταρική μήτρα, οδηγώντας στην επιβίωση των καρκινικών κυττάρων στην κυκλοφορία (Hamidi και Ivaska, 2018). Η μείωση της ιντεγκρίνης που προκαλείται από το CRISPR/Cas9 επιβραδύνει την εξέλιξη του όγκου, τη μετάσταση και τον αποικισμό στον TNBC. Έχει αναφερθεί ότι η μείωση της ιντεγκρίνης a5 (ITGA5) μειώνει τη μετανάστευση και την εξέλιξη των κυττάρων σε άλλους καρκίνους όπως ο καρκίνος του πνεύμονα (Ju et al., 2017), υποδηλώνοντας ότι η ιντεγκρίνη a5 μπορεί επίσης να είναι ένας βασικός παράγοντας στην παθογένεση του TNBC.
Η δημιουργία ποντικών με knockout χρησιμοποιώντας παραδοσιακές μεθόδους εμβρυϊκών βλαστικών κυττάρων (ES) είναι μια διαδικασία που απαιτεί πολλή εργασία, είναι χρονοβόρα και αναποτελεσματική. Χρειάζονται μήνες και χρόνια για να στοχεύσετε τα ES κύτταρα μέσω ομόλογου ανασυνδυασμού, να αναπαράγετε χιμαιρικά ποντίκια και στη συνέχεια να τα διασταυρώσετε με ετερόζυγα ποντίκια για να παράγετε ομόζυγους απογόνους. Απαιτείται σύνθετη διασταύρωση για τη δημιουργία ποντικών με πολλαπλές γενετικές μεταλλάξεις. Ωστόσο, έχουν προκύψει πολλά προβλήματα κατά τη χρήση ποντικών που δημιουργήθηκαν με αφαίρεση ES κυττάρων χρησιμοποιώντας CRISPR/Cas9 ή με μικροέγχυση συστατικών CRISPR/Cas9 σε μονοκύτταρα γονιμοποιημένα ωάρια. Για παράδειγμα, η εισαγωγή αλλαγών συμβαίνει συχνά σε διαλληλικούς τόπους και δεν είναι γονιδιακά ειδική. Πρόσφατα αναφέρθηκε ότι τα ES κύτταρα που χρησιμοποιούν τεχνολογία CRISPR/Cas9 μπορούν ταυτόχρονα να εισάγουν διαλληλικές μεταλλάξεις σε έως και 5 γονίδια (Nishizono et al., 2021). Για τον σκοπό αυτό, το mRNA Cas9 και πέντε gRNA ειδικά για γονίδια μεταμοσχεύθηκαν ταυτόχρονα σε ES κύτταρα. Αυτό υπογραμμίζει την υπόσχεση και την αποτελεσματικότητα αυτής της διαδικασίας, αν και αυτές οι μεταλλάξεις μπορεί να μεταβιβάστηκαν όταν οι ιδρυτικές σειρές διασταυρώθηκαν για να παράγουν πενταπλά knockout ποντίκια. Η μελέτη αναφέρει επίσης μια εκπληκτική ανακάλυψη: Τα εμβρυϊκά κύτταρα δεν απαιτούνται πλέον για τη δημιουργία γενετικά τροποποιημένων ποντικών. Αντ' αυτού, για την αφαίρεση συγκεκριμένων γονιδιακών προϊόντων, το mRNA και το gRNA Cas9 εγχύθηκαν σε έμβρυα μονοκυττάρου. Ως αποτέλεσμα, έχουν δημιουργηθεί ιδρυτικές σειρές knockout που μπορούν θεωρητικά να χρησιμοποιηθούν για τη μελέτη των συνεπειών της διαγραφής γονιδίων σε ποντίκια (Qin et al., 2016). Έτσι, το CRISPR/Cas9 επιτρέπει τη δημιουργία διαγονιδιακών ποντικών για τη θεραπεία του TNBC με χαμηλότερο κόστος από την παραδοσιακή γενετική μηχανική. Χρησιμοποιώντας το σύστημα CRISPR/Cas, έχει αναπτυχθεί ένα νέο μοντέλο ποντικού knockout που μπορεί να εισαγάγει με επιτυχία σημειακές μεταλλάξεις σε ένα ή περισσότερα ενδογενή γονίδια στο TNBC. Με βάση αυτήν την έννοια, ζωικά μοντέλα TNBC μπορούν επίσης να αναπτυχθούν χρησιμοποιώντας διαγραφή των BRCA1 και p53 με τη μεσολάβηση CRISPR/Cas9, με αποτέλεσμα την απώλεια της επιδιόρθωσης του HR, τη γονιδιωματική αστάθεια και τους μεταλλαγμένους φαινοτύπους (Annunziato et al., 2020).
Επί του παρόντος, για τη διάγνωση του TNBC χρησιμοποιούνται διάφορες μέθοδοι όπως η μαστογραφία, η μαγνητική τομογραφία (MRI) και ο υπέρηχος. Ωστόσο, αυτές οι μέθοδοι έχουν ορισμένους περιορισμούς. Η μαστογραφία χρησιμοποιείται για τη διάγνωση τοπικού ιστού μαστού και όχι μεταστάσεων, όπου τα καρκινικά κύτταρα έχουν μεταναστεύσει σε άλλα όργανα. Ο υπέρηχος δεν είναι μια αξιόπιστη μέθοδος για τη διάγνωση του TNBC (Chen και Lee-Felker, 2023). Η μαγνητική τομογραφία έχει υψηλότερη ευαισθησία από τον υπέρηχο και τη μαστογραφία, αλλά η διαγνωστική της ακρίβεια είναι περιορισμένη (Sha και Chen, 2022). Η βιοψία ιστού είναι ένας επεμβατικός τρόπος για την αναγνώριση καρκινικών κυττάρων. Ωστόσο, σε ορισμένες περιπτώσεις, μια βιοψία μπορεί να μην εντοπίσει καρκινικό ιστό εάν η βελόνα απομακρυνθεί από την περιοχή ενδιαφέροντος. Επιπλέον, είναι πολύ ακριβή και μπορεί να είναι τραυματική για τον ασθενή. Ο TNBC είναι ένας ετερογενής τύπος καρκίνου, επομένως μια βιοψία μπορεί να μην παρέχει αρκετές πληροφορίες σχετικά με τον τύπο του καρκίνου. Επομένως, απαιτείται επειγόντως μια νέα διαγνωστικά αξιόπιστη μέθοδος για την ανίχνευση του TNBC. Το CRISPR/Cas9 μπορεί να χρησιμεύσει ως μια εξαιρετικά ευαίσθητη και ελάχιστα επεμβατική εναλλακτική λύση για τη διάγνωση του καρκίνου του μαστού. Για τον σκοπό αυτό, οι στρατηγικές που βασίζονται στο CRISPR/Cas9 μπορούν να χρησιμοποιηθούν για τη βελτίωση των μεθόδων PCR για τη διάγνωση του TNBC. Πρώτον, οι πρωτεΐνες Cas9 και cpf1 του συστήματος CRISPR χρησιμοποιούνται για την αφαίρεση μη ειδικού DNA και στη συνέχεια αυτές οι δύο πρωτεΐνες (Cas9 και cpf1) μπορούν να αναγνωρίσουν την αλληλουχία PAM πριν συνδεθούν με το DNA-στόχο (Deepak Singh et al., 2021). Έτσι, η PCR μπορεί να εντοπίσει μεταλλάξεις που σχετίζονται με την ανάπτυξη καρκίνου. Αρκετές μελέτες έχουν υιοθετήσει αυτήν τη στρατηγική που βασίζεται στο CRISPR για την ανίχνευση διαφορετικών μεταλλάξεων σε διαφορετικούς καρκίνους (Safari et al., 2019). Έτσι, οι μέθοδοι PCR που βασίζονται στο CRISPR μπορούν να μειώσουν την εξάρτηση της διάγνωσης του TNBC από επεμβατικές μεθόδους όπως η ανοσοϊστοχημεία που βασίζεται σε βιοψία.
Γονοτυπικές αλλαγές στη ρύθμιση των ορμονικών υποδοχέων έχουν επίσης καταδειχθεί στο TNBC (Chen and Russo, 2009). Οι στρατηγικές PCR που βασίζονται στο CRISPR/Cas9 και χρησιμοποιούν μικροσυστοιχίες για διαγνωστικά σημεία φροντίδας μπορούν να παρακολουθήσουν αποτελεσματικά αυτές τις μεταλλάξεις (Hajian et al., 2019). Θα μπορούσαν επίσης να παρέχουν στους παρόχους υγειονομικής περίθαλψης σχετικές πληροφορίες σχετικά με συγκεκριμένες μεταλλάξεις σε ασθενείς με TNBC, οι οποίες θα μπορούσαν να βοηθήσουν στη βελτίωση της θεραπευτικής τους πορείας. Ωστόσο, αυτή η συνδυασμένη τεχνική έχει περιορισμούς. Επομένως, απαιτούνται εκτεταμένες ερευνητικές προσπάθειες πριν αυτή η μέθοδος CRISPR/Cas-PCR μπορεί να χρησιμοποιηθεί στην υγειονομική περίθαλψη για τη διάγνωση του TNBC (Yang et al., 2019).
Ώρα δημοσίευσης: 14 Οκτωβρίου 2024