Η διαφορική διάγνωση των πνευμονικών όζων που αναγνωρίζονται με αξονική τομογραφία (CT) παραμένει μια πρόκληση στην κλινική πράξη.Εδώ, χαρακτηρίζουμε το παγκόσμιο μεταβολίωμα 480 δειγμάτων ορού, συμπεριλαμβανομένων υγιών μαρτύρων, καλοήθων πνευμονικών οζιδίων και αδενοκαρκίνωμα πνεύμονα σταδίου Ι.Τα αδενοκαρκινώματα παρουσιάζουν μοναδικά μεταβολικά προφίλ, ενώ τα καλοήθη οζίδια και τα υγιή άτομα έχουν υψηλή ομοιότητα στα μεταβολομικά προφίλ.Στην ομάδα ανακάλυψης (n = 306), ένα σύνολο 27 μεταβολιτών αναγνωρίστηκε για τη διαφοροποίηση μεταξύ καλοήθων και κακοήθων όζων.Η AUC του μοντέλου διάκρισης στις ομάδες εσωτερικής επικύρωσης (n = 104) και εξωτερικής επικύρωσης (n = 111) ήταν 0,915 και 0,945, αντίστοιχα.Η ανάλυση οδού αποκάλυψε αυξημένους γλυκολυτικούς μεταβολίτες που σχετίζονται με μειωμένη τρυπτοφάνη στον ορό αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα σε σύγκριση με καλοήθεις όζους και υγιείς μάρτυρες και πρότεινε ότι η πρόσληψη τρυπτοφάνης προάγει τη γλυκόλυση στα καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα.Η μελέτη μας υπογραμμίζει την αξία των βιοδεικτών μεταβολίτη ορού στην αξιολόγηση του κινδύνου πνευμονικών οζιδίων που ανιχνεύονται με CT.
Η έγκαιρη διάγνωση είναι κρίσιμη για τη βελτίωση των ποσοστών επιβίωσης των καρκινοπαθών.Τα αποτελέσματα από την Εθνική Δοκιμή Προσυμπτωματικού Προσυμπτωματικού Καρκίνου του Πνεύμονα των ΗΠΑ (NLST) και την Ευρωπαϊκή Μελέτη NELSON έδειξαν ότι ο προσυμπτωματικός έλεγχος με υπολογιστική τομογραφία χαμηλής δόσης (LDCT) μπορεί να μειώσει σημαντικά τη θνησιμότητα από καρκίνο του πνεύμονα σε ομάδες υψηλού κινδύνου1,2,3.Μετά την ευρεία χρήση της LDCT για τον προσυμπτωματικό έλεγχο του καρκίνου του πνεύμονα, η συχνότητα των τυχαίων ευρημάτων ακτινογραφίας ασυμπτωματικών πνευμονικών όζων συνέχισε να αυξάνεται 4 .Τα πνευμονικά οζίδια ορίζονται ως εστιακές αδιαφάνειες διαμέτρου έως 3 cm 5 .Αντιμετωπίζουμε δυσκολίες στην εκτίμηση της πιθανότητας κακοήθειας και στην αντιμετώπιση του μεγάλου αριθμού πνευμονικών όζων που ανιχνεύθηκαν τυχαία στην LDCT.Οι περιορισμοί της αξονικής τομογραφίας μπορεί να οδηγήσουν σε συχνές εξετάσεις παρακολούθησης και ψευδώς θετικά αποτελέσματα, οδηγώντας σε περιττή παρέμβαση και υπερβολική θεραπεία6.Επομένως, υπάρχει ανάγκη να αναπτυχθούν αξιόπιστοι και χρήσιμοι βιοδείκτες για την ορθή αναγνώριση του καρκίνου του πνεύμονα στα αρχικά στάδια και τη διαφοροποίηση των περισσότερων καλοήθων όζων κατά την αρχική ανίχνευση 7 .
Η ολοκληρωμένη μοριακή ανάλυση του αίματος (ορός, πλάσμα, μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος), συμπεριλαμβανομένης της γονιδιωματικής, της πρωτεομικής ή της μεθυλίωσης του DNA8,9,10, οδήγησε σε αυξανόμενο ενδιαφέρον για την ανακάλυψη διαγνωστικών βιοδεικτών για τον καρκίνο του πνεύμονα.Εν τω μεταξύ, οι προσεγγίσεις της μεταβολομικής μετρούν τα κυτταρικά τελικά προϊόντα που επηρεάζονται από ενδογενείς και εξωγενείς δράσεις και επομένως εφαρμόζονται για την πρόβλεψη της έναρξης και της έκβασης της νόσου.Η υγρή χρωματογραφία-διαδοχική φασματομετρία μάζας (LC-MS) είναι μια ευρέως χρησιμοποιούμενη μέθοδος για μελέτες μεταβολομικής λόγω της υψηλής ευαισθησίας και του μεγάλου δυναμικού εύρους, που μπορεί να καλύψει μεταβολίτες με διαφορετικές φυσικοχημικές ιδιότητες11,12,13.Αν και η συνολική μεταβολική ανάλυση του πλάσματος/ορού έχει χρησιμοποιηθεί για τον εντοπισμό βιοδεικτών που σχετίζονται με τη διάγνωση του καρκίνου του πνεύμονα14,15,16,17 και την αποτελεσματικότητα της θεραπείας,18 ταξινομητές μεταβολιτών ορού για τη διάκριση μεταξύ καλοήθων και κακοήθων όζων του πνεύμονα πρέπει να μελετηθούν πολύ.- μαζική έρευνα.
Το αδενοκαρκίνωμα και το ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα είναι οι δύο κύριοι υποτύποι του μη μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα (NSCLC).Διάφορες εξετάσεις προσυμπτωματικού ελέγχου CT δείχνουν ότι το αδενοκαρκίνωμα είναι ο πιο κοινός ιστολογικός τύπος καρκίνου του πνεύμονα1,19,20,21.Σε αυτήν τη μελέτη, χρησιμοποιήσαμε φασματομετρία μάζας υγρής χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης (UPLC-HRMS) για να πραγματοποιήσουμε μεταβολομική ανάλυση σε συνολικά 695 δείγματα ορού, συμπεριλαμβανομένων υγιών μαρτύρων, καλοήθων πνευμονικών όζων και ανιχνευμένων με CT ≤3 cm.Έλεγχος για αδενοκαρκίνωμα πνεύμονα Σταδίου Ι.Εντοπίσαμε μια ομάδα μεταβολιτών ορού που διακρίνουν το αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα από τους καλοήθεις όζους και τους υγιείς μάρτυρες.Η ανάλυση εμπλουτισμού οδού αποκάλυψε ότι ο μη φυσιολογικός μεταβολισμός της τρυπτοφάνης και της γλυκόζης είναι συχνές αλλοιώσεις στο αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα σε σύγκριση με τους καλοήθεις όζους και τους υγιείς μάρτυρες.Τέλος, δημιουργήσαμε και επικυρώσαμε έναν μεταβολικό ταξινομητή ορού με υψηλή ειδικότητα και ευαισθησία για τη διάκριση μεταξύ κακοήθων και καλοήθων πνευμονικών όζων που ανιχνεύονται με LDCT, ο οποίος μπορεί να βοηθήσει στην έγκαιρη διαφορική διάγνωση και εκτίμηση κινδύνου.
Στην τρέχουσα μελέτη, δείγματα ορού αντιστοίχισης φύλου και ηλικίας συλλέχθηκαν αναδρομικά από 174 υγιείς μάρτυρες, 292 ασθενείς με καλοήθεις πνευμονικούς όζους και 229 ασθενείς με αδενοκαρκίνωμα πνεύμονα σταδίου Ι.Τα δημογραφικά χαρακτηριστικά των 695 ατόμων φαίνονται στον Συμπληρωματικό Πίνακα 1.
Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1α, συλλέχθηκαν συνολικά 480 δείγματα ορού, συμπεριλαμβανομένων 174 υγιών μαρτύρων (HC), 170 καλοήθων όζων (BN) και 136 δειγμάτων αδενοκαρκινώματος πνεύμονα (LA) σταδίου Ι, στο Κέντρο Καρκίνου του Πανεπιστημίου Sun Yat-sen.Κοόρτη ανακάλυψης για μη στοχευμένο μεταβολομικό προφίλ χρησιμοποιώντας υγρή χρωματογραφία υπερ-απόδοσης-φασματομετρία μάζας υψηλής ανάλυσης (UPLC-HRMS).Όπως φαίνεται στο Συμπληρωματικό Σχήμα 1, διαφορικοί μεταβολίτες μεταξύ LA και HC, LA και BN ταυτοποιήθηκαν για να καθιερωθεί ένα μοντέλο ταξινόμησης και να διερευνηθεί περαιτέρω η ανάλυση διαφορικής οδού.104 δείγματα που συλλέχθηκαν από το Κέντρο Καρκίνου του Πανεπιστημίου Sun Yat-sen και 111 δείγματα που συλλέχθηκαν από δύο άλλα νοσοκομεία υποβλήθηκαν σε εσωτερική και εξωτερική επικύρωση, αντίστοιχα.
πληθυσμός μελέτης στην κοόρτη ανακάλυψης που υποβλήθηκε σε συνολική μεταβολομική ανάλυση ορού χρησιμοποιώντας υγρή χρωματογραφία υπερ-απόδοσης-φασματοσκοπία μάζας υψηλής ανάλυσης (UPLC-HRMS).β Μερική διακριτική ανάλυση ελαχίστων τετραγώνων (PLS-DA) του συνολικού μεταβολισμού 480 δειγμάτων ορού από την κοόρτη της μελέτης, συμπεριλαμβανομένων υγιών μαρτύρων (HC, n = 174), καλοήθων οζιδίων (BN, n = 170) και αδενοκαρκίνωμα πνεύμονα σταδίου Ι (Λος Άντζελες, n = 136).+ESI, θετικός τρόπος ιονισμού ηλεκτροψεκασμού, -ESI, τρόπος ιονισμού αρνητικού ηλεκτροψεκασμού.c–e Μεταβολίτες με σημαντικά διαφορετική αφθονία σε δύο δεδομένες ομάδες (δοκιμή κατάταξης με υποσημείωση Wilcoxon με δύο ουρές, τιμή p προσαρμοσμένης στον ρυθμό εσφαλμένης ανακάλυψης, FDR <0,05) εμφανίζονται με κόκκινο (μεταβολή αναδίπλωσης > 1,2) και μπλε (μεταβολή πτυχής < 0,83) .) φαίνεται στο γραφικό του ηφαιστείου.f Θερμικός χάρτης ιεραρχικής ομαδοποίησης που δείχνει σημαντικές διαφορές στον αριθμό των σχολιασμένων μεταβολιτών μεταξύ LA και BN.Τα δεδομένα προέλευσης παρέχονται με τη μορφή αρχείων δεδομένων προέλευσης.
Το συνολικό μεταβολίωμα ορού των 174 HC, 170 BN και 136 LA στην ομάδα ανακάλυψης αναλύθηκε χρησιμοποιώντας ανάλυση UPLC-HRMS.Πρώτα δείχνουμε ότι τα δείγματα ποιοτικού ελέγχου (QC) συγκεντρώνονται στενά στο κέντρο ενός μοντέλου ανάλυσης κύριων συστατικών χωρίς επίβλεψη (PCA), επιβεβαιώνοντας τη σταθερότητα της απόδοσης της τρέχουσας μελέτης (Συμπληρωματικό Σχήμα 2).
Όπως φαίνεται στη μερική ανάλυση διάκρισης ελαχίστων τετραγώνων (PLS-DA) στο Σχήμα 1 β, διαπιστώσαμε ότι υπήρχαν σαφείς διαφορές μεταξύ LA και BN, LA και HC σε θετικούς (+ESI) και αρνητικούς (−ESI) τρόπους ιονισμού ηλεκτροψεκασμού .απομονωμένος.Ωστόσο, δεν βρέθηκαν σημαντικές διαφορές μεταξύ BN και HC σε συνθήκες +ESI και -ESI.
Βρήκαμε 382 διαφορικά χαρακτηριστικά μεταξύ LA και HC, 231 διαφορικά χαρακτηριστικά μεταξύ LA και BN και 95 διαφορικά χαρακτηριστικά μεταξύ BN και HC (δοκιμή κατάταξης με υπογραφή Wilcoxon, FDR <0,05 και πολλαπλή αλλαγή >1,2 ή <0,83) (Εικόνα .1c-e )..Οι κορυφές σημειώθηκαν περαιτέρω (Συμπληρωματικά Δεδομένα 3) σε μια βάση δεδομένων (βιβλιοθήκη mzCloud/HMDB/Chemspider) με βάση την τιμή m/z, τον χρόνο διατήρησης και την αναζήτηση φάσματος μάζας κατακερματισμού (λεπτομέρειες που περιγράφονται στην ενότητα Μέθοδοι) 22 .Τέλος, 33 και 38 σχολιασμένοι μεταβολίτες με σημαντικές διαφορές στην αφθονία εντοπίστηκαν για LA έναντι BN (Εικόνα 1f και Συμπληρωματικός Πίνακας 2) και LA έναντι HC (Συμπληρωματικό Σχήμα 3 και Συμπληρωματικός Πίνακας 2), αντίστοιχα.Αντίθετα, μόνο 3 μεταβολίτες με σημαντικές διαφορές στην αφθονία εντοπίστηκαν σε BN και HC (Συμπληρωματικός Πίνακας 2), σύμφωνα με την επικάλυψη μεταξύ BN και HC στο PLS-DA.Αυτοί οι διαφορικοί μεταβολίτες καλύπτουν ένα ευρύ φάσμα βιοχημικών ουσιών (Συμπληρωματικό Σχήμα 4).Συνολικά, αυτά τα αποτελέσματα καταδεικνύουν σημαντικές αλλαγές στο μεταβολισμό του ορού που αντικατοπτρίζουν τον κακοήθη μετασχηματισμό του πρώιμου σταδίου του καρκίνου του πνεύμονα σε σύγκριση με καλοήθεις πνευμονικούς όζους ή υγιή άτομα.Εν τω μεταξύ, η ομοιότητα του μεταβολισμού του ορού του BN και του HC υποδηλώνει ότι οι καλοήθεις πνευμονικοί όζοι μπορεί να μοιράζονται πολλά βιολογικά χαρακτηριστικά με υγιή άτομα.Δεδομένου ότι οι μεταλλάξεις του γονιδίου του υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR) είναι συχνές στον υποτύπο 23 του αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα, προσπαθήσαμε να προσδιορίσουμε τον αντίκτυπο των μεταλλάξεων οδηγών στο μεταβολισμό του ορού.Στη συνέχεια αναλύσαμε το συνολικό μεταβολικό προφίλ 72 περιπτώσεων με κατάσταση EGFR στην ομάδα του αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα.Είναι ενδιαφέρον ότι βρήκαμε συγκρίσιμα προφίλ μεταξύ ασθενών με μεταλλαγμένο EGFR (n = 41) και EGFR ασθενών άγριου τύπου (n = 31) στην ανάλυση PCA (Συμπληρωματικό Σχήμα 5α).Ωστόσο, εντοπίσαμε 7 μεταβολίτες των οποίων η αφθονία μεταβλήθηκε σημαντικά σε ασθενείς με μετάλλαξη EGFR σε σύγκριση με ασθενείς με άγριου τύπου EGFR (t test, p < 0,05 και αλλαγή πολλαπλασιασμού > 1,2 ή < 0,83) (Συμπληρωματικό Σχήμα 5β).Η πλειοψηφία αυτών των μεταβολιτών (5 στους 7) είναι ακυλοκαρνιτίνες, οι οποίες παίζουν σημαντικό ρόλο στις οδούς οξείδωσης των λιπαρών οξέων.
Όπως φαίνεται στη ροή εργασίας που φαίνεται στο Σχήμα 2 α, οι βιοδείκτες για την ταξινόμηση των οζιδίων ελήφθησαν χρησιμοποιώντας χειριστές ελάχιστης απόλυτης συρρίκνωσης και επιλογή με βάση 33 διαφορικούς μεταβολίτες που προσδιορίζονται στο LA (n = 136) και στο BN (n = 170).Καλύτερος συνδυασμός μεταβλητών (LASSO) – μοντέλο δυαδικής λογιστικής παλινδρόμησης.Χρησιμοποιήθηκε δεκαπλάσια διασταυρούμενη επικύρωση για να ελεγχθεί η αξιοπιστία του μοντέλου.Η επιλογή μεταβλητής και η τακτοποίηση παραμέτρων προσαρμόζονται από μια ποινή μεγιστοποίησης πιθανότητας με την παράμετρο λ24.Η συνολική μεταβολομική ανάλυση πραγματοποιήθηκε περαιτέρω ανεξάρτητα στις ομάδες εσωτερικής επικύρωσης (n = 104) και εξωτερικής επικύρωσης (n = 111) για να ελεγχθεί η απόδοση ταξινόμησης του μοντέλου διάκρισης.Ως αποτέλεσμα, 27 μεταβολίτες στο σύνολο ανακάλυψης αναγνωρίστηκαν ως το καλύτερο μοντέλο διάκρισης με τη μεγαλύτερη μέση τιμή AUC (Εικ. 2b), μεταξύ των οποίων 9 είχαν αυξημένη δραστηριότητα και 18 μειωμένη δραστηριότητα στο LA σε σύγκριση με το BN (Εικ. 2c).
Ροή εργασιών για τη δημιουργία ενός ταξινομητή πνευμονικών οζιδίων, συμπεριλαμβανομένης της επιλογής του καλύτερου πίνακα μεταβολιτών ορού στο σύνολο ανακάλυψης χρησιμοποιώντας ένα μοντέλο δυαδικής λογιστικής παλινδρόμησης μέσω δεκαπλάσιας διασταυρούμενης επικύρωσης και αξιολόγησης προγνωστικής απόδοσης σε σύνολα εσωτερικής και εξωτερικής επικύρωσης.β Στατιστικά διασταυρούμενης επικύρωσης του μοντέλου παλινδρόμησης LASSO για την επιλογή μεταβολικών βιοδεικτών.Οι αριθμοί που δίνονται παραπάνω αντιπροσωπεύουν τον μέσο αριθμό βιοδεικτών που επιλέχθηκαν σε ένα δεδομένο λ.Η κόκκινη διακεκομμένη γραμμή αντιπροσωπεύει τη μέση τιμή AUC στο αντίστοιχο λάμδα.Οι γκρι γραμμές σφάλματος αντιπροσωπεύουν τις ελάχιστες και μέγιστες τιμές AUC.Η διακεκομμένη γραμμή υποδεικνύει το καλύτερο μοντέλο με τους 27 επιλεγμένους βιοδείκτες.AUC, περιοχή κάτω από την καμπύλη χαρακτηριστικών λειτουργίας δέκτη (ROC).γ Διπλώστε τις αλλαγές 27 επιλεγμένων μεταβολιτών στην ομάδα LA σε σύγκριση με την ομάδα BN στην ομάδα ανακάλυψης.Κόκκινη στήλη – ενεργοποίηση.Η μπλε στήλη είναι παρακμή.d–f Καμπύλες χαρακτηριστικών λειτουργίας δέκτη (ROC) που δείχνουν την ισχύ του μοντέλου διάκρισης που βασίζεται σε 27 συνδυασμούς μεταβολιτών στα σύνολα ανακάλυψης, εσωτερικής και εξωτερικής επικύρωσης.Τα δεδομένα προέλευσης παρέχονται με τη μορφή αρχείων δεδομένων προέλευσης.
Δημιουργήθηκε ένα μοντέλο πρόβλεψης με βάση τους σταθμισμένους συντελεστές παλινδρόμησης αυτών των 27 μεταβολιτών (Συμπληρωματικός Πίνακας 3).Η ανάλυση ROC που βασίζεται σε αυτούς τους 27 μεταβολίτες έδωσε μια περιοχή κάτω από την τιμή της καμπύλης (AUC) 0,933, η ευαισθησία της ομάδας ανακάλυψης ήταν 0,868 και η ειδικότητα ήταν 0,859 (Εικ. 2δ).Εν τω μεταξύ, μεταξύ των 38 σχολιασμένων διαφορικών μεταβολιτών μεταξύ LA και HC, ένα σύνολο 16 μεταβολιτών πέτυχε AUC 0,902 με ευαισθησία 0,801 και ειδικότητα 0,856 στη διάκριση του LA από το HC (Συμπληρωματικό Σχήμα 6a-c).Συγκρίθηκαν επίσης οι τιμές AUC που βασίζονται σε διαφορετικά κατώφλια αλλαγής πτυχής για διαφορικούς μεταβολίτες.Βρήκαμε ότι το μοντέλο ταξινόμησης είχε καλύτερη απόδοση στη διάκριση μεταξύ LA και BN (HC) όταν το επίπεδο αλλαγής αναδίπλωσης ορίστηκε σε 1,2 έναντι 1,5 ή 2,0 (Συμπληρωματικό Σχήμα 7a,b).Το μοντέλο ταξινόμησης, που βασίζεται σε 27 ομάδες μεταβολιτών, επικυρώθηκε περαιτέρω σε εσωτερικές και εξωτερικές κοόρτες.Η AUC ήταν 0,915 (ευαισθησία 0,867, ειδικότητα 0,811) για εσωτερική επικύρωση και 0,945 (ευαισθησία 0,810, ειδικότητα 0,979) για εξωτερική επικύρωση (Εικ. 2e, f).Για την αξιολόγηση της διεργαστηριακής αποτελεσματικότητας, 40 δείγματα από την εξωτερική κοόρτη αναλύθηκαν σε εξωτερικό εργαστήριο όπως περιγράφεται στην ενότητα Μέθοδοι.Η ακρίβεια ταξινόμησης πέτυχε AUC 0,925 (Συμπληρωματικό Σχήμα 8).Επειδή το ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα του πνεύμονα (LUSC) είναι ο δεύτερος πιο κοινός υποτύπος μη μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα (NSCLC) μετά το αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα (LUAD), δοκιμάσαμε επίσης την επικυρωμένη πιθανή χρησιμότητα των μεταβολικών προφίλ.BN και 16 περιπτώσεις LUSC.Η AUC της διάκρισης μεταξύ LUSC και BN ήταν 0,776 (Συμπληρωματικό Σχήμα 9), υποδηλώνοντας μικρότερη ικανότητα σε σύγκριση με τη διάκριση μεταξύ LUAD και BN.
Μελέτες έχουν δείξει ότι το μέγεθος των οζιδίων στις εικόνες αξονικής τομογραφίας συσχετίζεται θετικά με την πιθανότητα κακοήθειας και παραμένει βασικός καθοριστικός παράγοντας για τη θεραπεία των οζιδίων25,26,27.Η ανάλυση των δεδομένων από τη μεγάλη κοόρτη της μελέτης προσυμπτωματικού ελέγχου NELSON έδειξε ότι ο κίνδυνος κακοήθειας σε άτομα με κόμβους <5 mm ήταν ακόμη παρόμοιος με αυτόν σε άτομα χωρίς κόμβους 28 .Επομένως, το ελάχιστο μέγεθος που απαιτεί τακτική παρακολούθηση με αξονική τομογραφία είναι 5 mm, όπως συνιστάται από την British Thoracic Society (BTS), και 6 mm, όπως συνιστάται από την Fleischner Society 29 .Ωστόσο, οζίδια μεγαλύτερα από 6 mm και χωρίς εμφανή καλοήθη χαρακτηριστικά, που ονομάζονται ακαθόριστα πνευμονικά οζίδια (IPN), παραμένουν μια σημαντική πρόκληση στην αξιολόγηση και τη διαχείριση στην κλινική πράξη30,31.Στη συνέχεια εξετάσαμε εάν το μέγεθος των όζων επηρέασε τις μεταβολομικές υπογραφές χρησιμοποιώντας συγκεντρωμένα δείγματα από τις κοόρτες ανακάλυψης και εσωτερικής επικύρωσης.Εστιάζοντας σε 27 επικυρωμένους βιοδείκτες, συγκρίναμε αρχικά τα προφίλ PCA των μεταβολισμών HC και BN κάτω των 6 mm.Βρήκαμε ότι τα περισσότερα από τα σημεία δεδομένων για HC και BN αλληλεπικαλύπτονταν, αποδεικνύοντας ότι τα επίπεδα μεταβολιτών στον ορό ήταν παρόμοια και στις δύο ομάδες (Εικ. 3α).Οι χάρτες χαρακτηριστικών σε διαφορετικά εύρη μεγεθών παρέμειναν διατηρημένοι σε BN και LA (Εικ. 3b, c), ενώ παρατηρήθηκε διαχωρισμός μεταξύ κακοήθων και καλοήθων όζων στην περιοχή 6-20 mm (Εικ. 3d).Αυτή η κοόρτη είχε AUC 0,927, ειδικότητα 0,868 και ευαισθησία 0,820 για την πρόβλεψη της κακοήθειας όζων μεγέθους 6 έως 20 mm (Εικ. 3e, f).Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι ο ταξινομητής μπορεί να καταγράψει μεταβολικές αλλαγές που προκαλούνται από πρώιμο κακοήθη μετασχηματισμό, ανεξάρτητα από το μέγεθος του οζιδίου.
ad Σύγκριση των προφίλ PCA μεταξύ καθορισμένων ομάδων με βάση έναν μεταβολικό ταξινομητή 27 μεταβολιτών.CC και BN < 6 mm.b BN < 6 mm vs BN 6–20 mm.σε LA 6–20 mm έναντι LA 20–30 mm.g BN 6–20 mm και LA 6–20 mm.GC, η = 174;BN < 6 mm, n = 153;BN 6–20 mm, n = 91;LA 6–20 mm, n = 89;LA 20–30 mm, n = 77. e Καμπύλη χαρακτηριστικής λειτουργίας δέκτη (ROC) που δείχνει διακριτική απόδοση μοντέλου για οζίδια 6–20 mm.f Οι τιμές πιθανότητας υπολογίστηκαν με βάση το μοντέλο λογιστικής παλινδρόμησης για οζίδια διαστάσεων 6–20 mm.Η γκρίζα διακεκομμένη γραμμή αντιπροσωπεύει τη βέλτιστη τιμή αποκοπής (0,455).Οι παραπάνω αριθμοί αντιπροσωπεύουν το ποσοστό των περιπτώσεων που προβλέπονται για το Λος Άντζελες.Χρησιμοποιήστε ένα τεστ Student's t δύο ουρών.PCA, ανάλυση κύριου συστατικού.Περιοχή AUC κάτω από την καμπύλη.Τα δεδομένα προέλευσης παρέχονται με τη μορφή αρχείων δεδομένων προέλευσης.
Τέσσερα δείγματα (ηλικίας 44-61 ετών) με παρόμοια μεγέθη πνευμονικών οζιδίων (7-9 mm) επιλέχθηκαν περαιτέρω για να απεικονίσουν την απόδοση του προτεινόμενου μοντέλου πρόβλεψης κακοήθειας (Εικ. 4α, β).Στην αρχική εξέταση, η περίπτωση 1 παρουσιάστηκε ως συμπαγής όζος με ασβεστοποίηση, χαρακτηριστικό που σχετίζεται με καλοήθεια, ενώ η περίπτωση 2 παρουσιάστηκε ως απροσδιόριστο μερικώς συμπαγές οζίδιο χωρίς εμφανή καλοήθη χαρακτηριστικά.Τρεις γύροι αξονικών τομογραφιών παρακολούθησης έδειξαν ότι αυτές οι περιπτώσεις παρέμειναν σταθερές για μια περίοδο 4 ετών και επομένως θεωρήθηκαν καλοήθη οζίδια (Εικ. 4α).Σε σύγκριση με την κλινική αξιολόγηση των σειριακών αξονικών τομογραφιών, η ανάλυση μεταβολίτη ορού μονής λήψης με το τρέχον μοντέλο ταξινομητή αναγνώρισε γρήγορα και σωστά αυτά τα καλοήθη οζίδια με βάση πιθανολογικούς περιορισμούς (Πίνακας 1).Το Σχήμα 4β στην περίπτωση 3 δείχνει ένα οζίδιο με σημεία υπεζωκοτικής απόσυρσης, το οποίο σχετίζεται συχνότερα με κακοήθεια32.Η περίπτωση 4 παρουσιάστηκε ως ένας απροσδιόριστος μερικώς συμπαγής όζος χωρίς στοιχεία καλοήθους αιτίας.Όλες αυτές οι περιπτώσεις προβλέφθηκαν ως κακοήθεις σύμφωνα με το μοντέλο ταξινομητή (Πίνακας 1).Η εκτίμηση του αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα αποδείχθηκε με ιστοπαθολογική εξέταση μετά από χειρουργική επέμβαση εκτομής πνεύμονα (Εικ. 4β).Για το σύνολο εξωτερικής επικύρωσης, ο μεταβολικός ταξινομητής προέβλεψε με ακρίβεια δύο περιπτώσεις απροσδιόριστων πνευμονικών οζιδίων μεγαλύτερων από 6 mm (Συμπληρωματικό Σχήμα 10).
Εικόνες αξονικής τομογραφίας του αξονικού παραθύρου των πνευμόνων δύο περιπτώσεων καλοήθων όζων.Στην περίπτωση 1, η αξονική τομογραφία μετά από 4 χρόνια έδειξε ένα σταθερό συμπαγές οζίδιο διαστάσεων 7 mm με ασβεστοποίηση στον δεξιό κάτω λοβό.Στην περίπτωση 2, η αξονική τομογραφία μετά από 5 χρόνια αποκάλυψε ένα σταθερό, μερικώς συμπαγές οζίδιο με διάμετρο 7 mm στον δεξιό άνω λοβό.β Αξονικές εικόνες αξονικής τομογραφίας παραθύρου των πνευμόνων και αντίστοιχες παθολογικές μελέτες δύο περιπτώσεων αδενοκαρκινώματος σταδίου Ι πριν από την εκτομή του πνεύμονα.Η περίπτωση 3 αποκάλυψε ένα οζίδιο με διάμετρο 8 mm στον δεξιό άνω λοβό με υπεζωκοτική ανάκληση.Η περίπτωση 4 αποκάλυψε ένα μερικώς συμπαγές οζίδιο από εσμυρισμένο γυαλί μεγέθους 9 mm στον αριστερό άνω λοβό.Χρώση αιματοξυλίνης και ηωσίνης (Η&Ε) του εκτομημένου πνευμονικού ιστού (γραμμή κλίμακας = 50 μm) που καταδεικνύει το μοτίβο ανάπτυξης της κυψελίδας του αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα.Τα βέλη υποδεικνύουν οζίδια που ανιχνεύονται σε εικόνες CT.Οι εικόνες H&E είναι αντιπροσωπευτικές εικόνες πολλαπλών (>3) μικροσκοπικών πεδίων που εξετάζονται από τον παθολόγο.
Συνολικά, τα αποτελέσματά μας καταδεικνύουν τη δυνητική αξία των βιοδεικτών μεταβολίτη ορού στη διαφορική διάγνωση των πνευμονικών οζιδίων, η οποία μπορεί να δημιουργήσει προκλήσεις κατά την αξιολόγηση της εξέτασης CT.
Με βάση ένα επικυρωμένο πάνελ διαφορικών μεταβολιτών, επιδιώξαμε να εντοπίσουμε βιολογικούς συσχετισμούς μεγάλων μεταβολικών αλλαγών.Η ανάλυση εμπλουτισμού της οδού KEGG από το MetaboAnalyst εντόπισε 6 κοινές σημαντικά αλλαγμένες οδούς μεταξύ των δύο δεδομένων ομάδων (LA έναντι HC και LA έναντι BN, προσαρμοσμένο p ≤ 0,001, αποτέλεσμα > 0,01).Αυτές οι αλλαγές χαρακτηρίστηκαν από διαταραχές στον μεταβολισμό του πυροσταφυλικού, στο μεταβολισμό της τρυπτοφάνης, στο μεταβολισμό της νιασίνης και της νικοτιναμίδης, στη γλυκόλυση, στον κύκλο TCA και στον μεταβολισμό των πουρινών (Εικ. 5α).Στη συνέχεια πραγματοποιήσαμε περαιτέρω στοχευμένη μεταβολομική για να επαληθεύσουμε σημαντικές αλλαγές χρησιμοποιώντας απόλυτη ποσοτικοποίηση.Προσδιορισμός κοινών μεταβολιτών σε κοινά αλλαγμένα μονοπάτια με τριπλή τετραπολική φασματομετρία μάζας (QQQ) χρησιμοποιώντας αυθεντικά πρότυπα μεταβολιτών.Τα δημογραφικά χαρακτηριστικά του δείγματος στόχου της μελέτης μεταβολομικής περιλαμβάνονται στον Συμπληρωματικό Πίνακα 4. Σε συμφωνία με τα αποτελέσματα της παγκόσμιας μεταβολομικής μας, η ποσοτική ανάλυση επιβεβαίωσε ότι η υποξανθίνη και η ξανθίνη, το πυροσταφυλικό και το γαλακτικό ήταν αυξημένα στο LA σε σύγκριση με το BN και το HC (Εικ. 5b, c, p <0,05).Ωστόσο, δεν βρέθηκαν σημαντικές διαφορές σε αυτούς τους μεταβολίτες μεταξύ BN και HC.
Ανάλυση εμπλουτισμού οδού KEGG σημαντικών διαφορετικών μεταβολιτών στην ομάδα LA σε σύγκριση με τις ομάδες BN και HC.Χρησιμοποιήθηκε ένα Globaltest με δύο ουρές και οι τιμές p προσαρμόστηκαν χρησιμοποιώντας τη μέθοδο Holm-Bonferroni (προσαρμοσμένο p ≤ 0,001 και μέγεθος εφέ > 0,01).b–d Διαγράμματα βιολιού που δείχνουν επίπεδα υποξανθίνης, ξανθίνης, γαλακτικού, πυροσταφυλικού και τρυπτοφάνης στον ορό HC, BN και LA που προσδιορίζονται με LC-MS/MS (n = 70 ανά ομάδα).Οι λευκές και οι μαύρες διακεκομμένες γραμμές υποδεικνύουν τη διάμεσο και το τεταρτημόριο, αντίστοιχα.e Διάγραμμα βιολιού που δείχνει κανονικοποιημένη Log2TPM (μεταγραφές ανά εκατομμύριο) έκφραση mRNA του SLC7A5 και του QPRT στο αδενοκαρκίνωμα πνεύμονα (n = 513) σε σύγκριση με τον φυσιολογικό πνευμονικό ιστό (n = 59) στο σύνολο δεδομένων LUAD-TCGA.Το λευκό πλαίσιο αντιπροσωπεύει το εύρος των τεταρτημορίων, η οριζόντια μαύρη γραμμή στο κέντρο αντιπροσωπεύει τη διάμεσο και η κάθετη μαύρη γραμμή που εκτείνεται από το πλαίσιο αντιπροσωπεύει το διάστημα εμπιστοσύνης 95% (CI).f Διάγραμμα συσχέτισης Pearson της έκφρασης SLC7A5 και GAPDH σε αδενοκαρκίνωμα πνεύμονα (n = 513) και φυσιολογικό πνευμονικό ιστό (n = 59) στο σύνολο δεδομένων TCGA.Η γκρίζα περιοχή αντιπροσωπεύει το 95% CI.r, συντελεστής συσχέτισης Pearson.g Ομαλοποιημένα επίπεδα κυτταρικής τρυπτοφάνης σε κύτταρα Α549 επιμολυσμένα με μη ειδικό έλεγχο shRNA (NC) και shSLC7A5 (Sh1, Sh2) που προσδιορίστηκαν με LC-MS/MS.Παρουσιάζεται στατιστική ανάλυση πέντε βιολογικά ανεξάρτητων δειγμάτων σε κάθε ομάδα.h Τα κυτταρικά επίπεδα NADt (συνολικό NAD, συμπεριλαμβανομένων των NAD+ και NADH) σε κύτταρα A549 (NC) και SLC7A5 κλονίζουν τα κύτταρα A549 (Sh1, Sh2).Παρουσιάζεται στατιστική ανάλυση τριών βιολογικά ανεξάρτητων δειγμάτων σε κάθε ομάδα.i Η γλυκολυτική δραστηριότητα των κυττάρων A549 πριν και μετά την καταστροφή του SLC7A5 μετρήθηκε με ρυθμό εξωκυτταρικής οξίνισης (ECAR) (n = 4 βιολογικά ανεξάρτητα δείγματα ανά ομάδα).2-DG,2-δεοξυ-D-γλυκόζη.Το τεστ t δύο ουρών Student χρησιμοποιήθηκε στο (b–h).Στο (g–i), οι γραμμές σφάλματος αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SD, κάθε πείραμα εκτελέστηκε τρεις φορές ανεξάρτητα και τα αποτελέσματα ήταν παρόμοια.Τα δεδομένα προέλευσης παρέχονται με τη μορφή αρχείων δεδομένων προέλευσης.
Λαμβάνοντας υπόψη τη σημαντική επίδραση του αλλοιωμένου μεταβολισμού τρυπτοφάνης στην ομάδα LA, αξιολογήσαμε επίσης τα επίπεδα τρυπτοφάνης στον ορό στις ομάδες HC, BN και LA χρησιμοποιώντας QQQ.Βρήκαμε ότι η τρυπτοφάνη ορού ήταν μειωμένη στο LA σε σύγκριση με το HC ή το BN (p < 0,001, Εικόνα 5δ), το οποίο είναι σύμφωνο με προηγούμενα ευρήματα ότι τα επίπεδα τρυπτοφάνης στην κυκλοφορία είναι χαμηλότερα σε ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα από ότι σε υγιείς μάρτυρες από την ομάδα ελέγχου33,34 ,35.Μια άλλη μελέτη που χρησιμοποιούσε τον ιχνηθέτη PET/CT 11C-methyl-L-tryptophan διαπίστωσε ότι ο χρόνος κατακράτησης του σήματος τρυπτοφάνης στον ιστό του καρκίνου του πνεύμονα ήταν σημαντικά αυξημένος σε σύγκριση με τις καλοήθεις βλάβες ή τον φυσιολογικό ιστό36.Υποθέτουμε ότι η μείωση της τρυπτοφάνης στον ορό LA μπορεί να αντανακλά την ενεργή πρόσληψη τρυπτοφάνης από τα καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα.
Είναι επίσης γνωστό ότι το τελικό προϊόν της οδού κυνουρενίνης του καταβολισμού της τρυπτοφάνης είναι το NAD+37,38, το οποίο αποτελεί σημαντικό υπόστρωμα για την αντίδραση της 3-φωσφορικής γλυκεραλδεΰδης με το 1,3-διφωσφογλυκερικό στη γλυκόλυση39.Ενώ προηγούμενες μελέτες είχαν επικεντρωθεί στον ρόλο του καταβολισμού τρυπτοφάνης στη ρύθμιση του ανοσοποιητικού συστήματος, προσπαθήσαμε να διευκρινίσουμε την αλληλεπίδραση μεταξύ της απορρύθμισης της τρυπτοφάνης και των γλυκολυτικών οδών που παρατηρήθηκαν στην τρέχουσα μελέτη.Η οικογένεια μεταφορέα διαλυμένης ουσίας 7 μέλη 5 (SLC7A5) είναι γνωστό ότι είναι μεταφορέας τρυπτοφάνης43,44,45.Η φωσφοριβοσυλτρανσφεράση του κινολινικού οξέος (QPRT) είναι ένα ένζυμο που βρίσκεται κατάντη της οδού κυνουρενίνης που μετατρέπει το κινολινικό οξύ σε NAMN46.Η επιθεώρηση του συνόλου δεδομένων LUAD TCGA αποκάλυψε ότι τόσο το SLC7A5 όσο και το QPRT ρυθμίστηκαν σημαντικά προς τα πάνω στον ιστό όγκου σε σύγκριση με τον φυσιολογικό ιστό (Εικ. 5e).Αυτή η αύξηση παρατηρήθηκε στα στάδια I και II καθώς και στα στάδια III και IV του αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα (Συμπληρωματικό Σχήμα 11), υποδεικνύοντας πρώιμες διαταραχές στο μεταβολισμό της τρυπτοφάνης που σχετίζονται με την ογκογένεση.
Επιπλέον, το σύνολο δεδομένων LUAD-TCGA έδειξε θετική συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης mRNA του SLC7A5 και του GAPDH σε δείγματα ασθενών με καρκίνο (r = 0,45, p = 1,55E-26, Εικόνα 5στ).Αντίθετα, δεν βρέθηκε σημαντική συσχέτιση μεταξύ τέτοιων γονιδιακών υπογραφών σε φυσιολογικό πνευμονικό ιστό (r = 0,25, p = 0,06, Εικόνα 5στ).Η καταστροφή του SLC7A5 (Συμπληρωματικό Σχήμα 12) σε κύτταρα A549 μείωσε σημαντικά τα επίπεδα κυτταρικής τρυπτοφάνης και NAD(H) (Εικόνα 5g,h), με αποτέλεσμα εξασθενημένη γλυκολυτική δραστηριότητα όπως μετράται με ρυθμό εξωκυτταρικής οξίνισης (ECAR) (Εικόνα 1).5i).Έτσι, με βάση τις μεταβολικές αλλαγές στον ορό και την in vitro ανίχνευση, υποθέτουμε ότι ο μεταβολισμός της τρυπτοφάνης μπορεί να παράγει NAD+ μέσω της οδού κυνουρενίνης και να παίζει σημαντικό ρόλο στην προώθηση της γλυκόλυσης στον καρκίνο του πνεύμονα.
Μελέτες έχουν δείξει ότι ένας μεγάλος αριθμός απροσδιόριστων πνευμονικών όζων που ανιχνεύονται με LDCT μπορεί να οδηγήσει στην ανάγκη για πρόσθετες εξετάσεις όπως PET-CT, βιοψία πνεύμονα και υπερβολική θεραπεία λόγω ψευδώς θετικής διάγνωσης κακοήθειας.31 Όπως φαίνεται στο Σχήμα 6. Η μελέτη μας εντόπισε μια ομάδα μεταβολιτών ορού με πιθανή διαγνωστική αξία που μπορεί να βελτιώσει τη διαστρωμάτωση κινδύνου και την επακόλουθη διαχείριση των πνευμονικών όζων που ανιχνεύονται με CT.
Τα πνευμονικά οζίδια αξιολογούνται χρησιμοποιώντας υπολογιστική τομογραφία χαμηλής δόσης (LDCT) με απεικονιστικά χαρακτηριστικά που υποδηλώνουν καλοήθη ή κακοήθη αίτια.Η αβέβαιη έκβαση των οζιδίων μπορεί να οδηγήσει σε συχνές επισκέψεις παρακολούθησης, περιττές παρεμβάσεις και υπερβολική θεραπεία.Η συμπερίληψη μεταβολικών ταξινομητών ορού με διαγνωστική αξία μπορεί να βελτιώσει την αξιολόγηση κινδύνου και την επακόλουθη διαχείριση των πνευμονικών όζων.Τομογραφία εκπομπής ποζιτρονίων PET.
Τα δεδομένα από τη μελέτη NLST των ΗΠΑ και την ευρωπαϊκή μελέτη NELSON υποδηλώνουν ότι ο προσυμπτωματικός έλεγχος ομάδων υψηλού κινδύνου με υπολογιστική τομογραφία χαμηλής δόσης (LDCT) μπορεί να μειώσει τη θνησιμότητα από καρκίνο του πνεύμονα1,3.Ωστόσο, η αξιολόγηση κινδύνου και η επακόλουθη κλινική διαχείριση μεγάλου αριθμού τυχαίων πνευμονικών οζιδίων που ανιχνεύονται με LDCT παραμένουν οι πιο προκλήσεις.Ο κύριος στόχος είναι να βελτιστοποιηθεί η σωστή ταξινόμηση των υφιστάμενων πρωτοκόλλων που βασίζονται σε LDCT με την ενσωμάτωση αξιόπιστων βιοδεικτών.
Ορισμένοι μοριακοί βιοδείκτες, όπως οι μεταβολίτες του αίματος, έχουν εντοπιστεί συγκρίνοντας τον καρκίνο του πνεύμονα με υγιείς μάρτυρες15,17.Στην τρέχουσα μελέτη, εστιάσαμε στην εφαρμογή της μεταβολομικής ανάλυσης ορού για τη διάκριση μεταξύ καλοήθων και κακοήθων πνευμονικών όζων που ανιχνεύθηκαν τυχαία με LDCT.Συγκρίναμε το παγκόσμιο μεταβολίωμα ορού υγιούς ελέγχου (HC), καλοήθων όζων πνεύμονα (BN) και δειγμάτων αδενοκαρκινώματος πνεύμονα σταδίου Ι (LA) χρησιμοποιώντας ανάλυση UPLC-HRMS.Βρήκαμε ότι το HC και το BN είχαν παρόμοια μεταβολικά προφίλ, ενώ το LA παρουσίασε σημαντικές αλλαγές σε σύγκριση με το HC και το BN.Εντοπίσαμε δύο ομάδες μεταβολιτών ορού που διαφοροποιούν το LA από το HC και το BN.
Το τρέχον σχήμα αναγνώρισης που βασίζεται σε LDCT για καλοήθεις και κακοήθεις όζους βασίζεται κυρίως στο μέγεθος, την πυκνότητα, τη μορφολογία και τον ρυθμό ανάπτυξης των όζων με την πάροδο του χρόνου30.Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι το μέγεθος των όζων σχετίζεται στενά με την πιθανότητα καρκίνου του πνεύμονα.Ακόμη και σε ασθενείς υψηλού κινδύνου, ο κίνδυνος κακοήθειας σε κόμβους <6 mm είναι <1%.Ο κίνδυνος κακοήθειας για οζίδια διαστάσεων 6 έως 20 mm κυμαίνεται από 8% έως 64%30.Επομένως, η Εταιρεία Fleischner συνιστά διάμετρο αποκοπής 6 mm για παρακολούθηση ρουτίνας CT.29 Ωστόσο, η αξιολόγηση κινδύνου και η διαχείριση ακαθόριστων πνευμονικών όζων (IPN) μεγαλύτερων από 6 mm δεν έχουν πραγματοποιηθεί επαρκώς 31 .Η τρέχουσα διαχείριση της συγγενούς καρδιοπάθειας βασίζεται συνήθως σε προσεκτική αναμονή με συχνή παρακολούθηση CT.
Με βάση το επικυρωμένο μεταβολισμό, δείξαμε για πρώτη φορά την επικάλυψη μεταβολικών υπογραφών μεταξύ υγιών ατόμων και καλοήθων οζιδίων <6 mm.Η βιολογική ομοιότητα είναι σύμφωνη με προηγούμενα ευρήματα CT ότι ο κίνδυνος κακοήθειας για οζίδια <6 mm είναι τόσο χαμηλός όσο και για άτομα χωρίς κόμβους.30 Θα πρέπει να σημειωθεί ότι τα αποτελέσματά μας δείχνουν επίσης ότι τα καλοήθη οζίδια <6 mm και ≥6 mm έχουν υψηλό ομοιότητα στα μεταβολομικά προφίλ, υποδηλώνοντας ότι ο λειτουργικός ορισμός της καλοήθους αιτιολογίας είναι συνεπής ανεξάρτητα από το μέγεθος του οζιδίου.Έτσι, τα σύγχρονα διαγνωστικά πάνελ μεταβολιτών ορού μπορεί να παρέχουν μια μοναδική ανάλυση ως δοκιμασία αποκλεισμού όταν αρχικά ανιχνεύονται οζίδια στην αξονική τομογραφία και δυνητικά μειώνουν τη σειριακή παρακολούθηση.Ταυτόχρονα, η ίδια ομάδα μεταβολικών βιοδεικτών διέκρινε κακοήθεις όζους μεγέθους ≥6 mm από καλοήθεις όζους και παρείχε ακριβείς προβλέψεις για IPN παρόμοιου μεγέθους και διφορούμενα μορφολογικά χαρακτηριστικά σε εικόνες CT.Αυτός ο ταξινομητής μεταβολισμού ορού απέδωσε καλά στην πρόβλεψη της κακοήθειας οζιδίων ≥6 mm με AUC 0,927.Συνολικά, τα αποτελέσματά μας υποδεικνύουν ότι οι μοναδικές μεταβολικές υπογραφές στον ορό μπορεί να αντανακλούν συγκεκριμένα τις πρώιμες μεταβολικές αλλαγές που προκαλούνται από όγκο και να έχουν πιθανή αξία ως προγνωστικοί παράγοντες κινδύνου, ανεξάρτητα από το μέγεθος των όζων.
Συγκεκριμένα, το αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα (LUAD) και το ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα (LUSC) είναι οι κύριοι τύποι μη μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα (NSCLC).Δεδομένου ότι το LUSC συνδέεται στενά με τη χρήση καπνού47 και το LUAD είναι η πιο κοινή ιστολογία των τυχαίων όζων του πνεύμονα που ανιχνεύθηκαν στην εξέταση CT48, το μοντέλο ταξινομητή μας κατασκευάστηκε ειδικά για δείγματα αδενοκαρκινώματος σταδίου Ι.Ο Wang και οι συνεργάτες του εστίασαν επίσης στο LUAD και εντόπισαν εννέα λιπιδικές υπογραφές χρησιμοποιώντας λιπιδομικά για να διακρίνουν τον καρκίνο του πνεύμονα σε πρώιμο στάδιο από υγιή άτομα17.Δοκιμάσαμε το τρέχον μοντέλο ταξινομητή σε 16 περιπτώσεις LUSC σταδίου I και 74 καλοήθεις οζίδια και παρατηρήσαμε χαμηλή ακρίβεια πρόβλεψης LUSC (AUC 0,776), υποδηλώνοντας ότι το LUAD και το LUSC μπορεί να έχουν τις δικές τους μεταβολικές υπογραφές.Πράγματι, το LUAD και το LUSC έχει αποδειχθεί ότι διαφέρουν ως προς την αιτιολογία, τη βιολογική προέλευση και τις γενετικές εκτροπές49.Ως εκ τούτου, άλλοι τύποι ιστολογίας θα πρέπει να περιλαμβάνονται σε μοντέλα εκπαίδευσης για την ανίχνευση του καρκίνου του πνεύμονα βάσει πληθυσμού στα προγράμματα προσυμπτωματικού ελέγχου.
Εδώ, εντοπίσαμε τις έξι πιο συχνά μεταβαλλόμενες οδούς στο αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα σε σύγκριση με υγιείς μάρτυρες και καλοήθεις όζους.Η ξανθίνη και η υποξανθίνη είναι κοινοί μεταβολίτες της μεταβολικής οδού πουρίνης.Σύμφωνα με τα αποτελέσματά μας, τα ενδιάμεσα που σχετίζονται με το μεταβολισμό των πουρινών αυξήθηκαν σημαντικά στον ορό ή τους ιστούς ασθενών με αδενοκαρκίνωμα πνεύμονα σε σύγκριση με υγιείς μάρτυρες ή ασθενείς στο προεπεμβατικό στάδιο15,50.Τα αυξημένα επίπεδα ξανθίνης και υποξανθίνης στον ορό μπορεί να αντανακλούν τον αναβολισμό που απαιτείται από τα ταχέως πολλαπλασιαζόμενα καρκινικά κύτταρα.Η απορύθμιση του μεταβολισμού της γλυκόζης είναι γνωστό χαρακτηριστικό του μεταβολισμού του καρκίνου51.Εδώ, παρατηρήσαμε σημαντική αύξηση του πυροσταφυλικού και του γαλακτικού στην ομάδα LA σε σύγκριση με την ομάδα HC και BN, η οποία είναι σύμφωνη με προηγούμενες αναφορές ανωμαλιών της γλυκολυτικής οδού στα προφίλ μεταβολισμού ορού ασθενών με μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) και υγιείς ελέγχους.τα αποτελέσματα είναι συνεπή52,53.
Είναι σημαντικό ότι παρατηρήσαμε μια αντίστροφη συσχέτιση μεταξύ του μεταβολισμού του πυροσταφυλικού και της τρυπτοφάνης στον ορό των πνευμονικών αδενοκαρκινωμάτων.Τα επίπεδα τρυπτοφάνης στον ορό μειώθηκαν στην ομάδα LA σε σύγκριση με την ομάδα HC ή BN.Είναι ενδιαφέρον ότι μια προηγούμενη μεγάλης κλίμακας μελέτη που χρησιμοποιούσε μια προοπτική κοόρτη διαπίστωσε ότι τα χαμηλά επίπεδα κυκλοφορούσας τρυπτοφάνης συσχετίστηκαν με αυξημένο κίνδυνο καρκίνου του πνεύμονα 54 .Η τρυπτοφάνη είναι ένα απαραίτητο αμινοξύ που λαμβάνουμε εξ ολοκλήρου από τα τρόφιμα.Συμπεραίνουμε ότι η μείωση της τρυπτοφάνης ορού στο αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα μπορεί να αντανακλά την ταχεία εξάντληση αυτού του μεταβολίτη.Είναι ευρέως γνωστό ότι το τελικό προϊόν του καταβολισμού της τρυπτοφάνης μέσω της οδού κυνουρενίνης είναι η πηγή της de novo σύνθεσης NAD+.Επειδή το NAD+ παράγεται κυρίως μέσω της οδού διάσωσης, η σημασία του NAD+ στον μεταβολισμό της τρυπτοφάνης για την υγεία και τις ασθένειες μένει να προσδιοριστεί46.Η ανάλυσή μας στη βάση δεδομένων TCGA έδειξε ότι η έκφραση του μεταφορέα διαλυμένης ουσίας μεταφορέα τρυπτοφάνης 7A5 (SLC7A5) αυξήθηκε σημαντικά στο αδενοκαρκίνωμα πνεύμονα σε σύγκριση με τους φυσιολογικούς μάρτυρες και συσχετίστηκε θετικά με την έκφραση του γλυκολυτικού ενζύμου GAPDH.Προηγούμενες μελέτες έχουν επικεντρωθεί κυρίως στον ρόλο του καταβολισμού τρυπτοφάνης στην καταστολή της αντικαρκινικής ανοσολογικής απόκρισης40,41,42.Εδώ αποδεικνύουμε ότι η αναστολή της πρόσληψης τρυπτοφάνης με την καταστροφή του SLC7A5 στα καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα έχει ως αποτέλεσμα μια επακόλουθη μείωση στα κυτταρικά επίπεδα NAD και μια ταυτόχρονη εξασθένηση της γλυκολυτικής δραστηριότητας.Συνοπτικά, η μελέτη μας παρέχει μια βιολογική βάση για αλλαγές στον μεταβολισμό του ορού που σχετίζονται με κακοήθη μετασχηματισμό του αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα.
Οι μεταλλάξεις EGFR είναι οι πιο συχνές μεταλλάξεις-οδηγοί σε ασθενείς με ΜΜΚΠ.Στη μελέτη μας, διαπιστώσαμε ότι οι ασθενείς με μετάλλαξη EGFR (n = 41) είχαν συνολικά μεταβολικά προφίλ παρόμοια με ασθενείς με άγριου τύπου EGFR (n = 31), αν και βρήκαμε μειωμένα επίπεδα ορού ορισμένων ασθενών με μετάλλαξη EGFR σε ασθενείς με ακυλκαρνιτίνη.Η καθιερωμένη λειτουργία των ακυλοκαρνιτινών είναι να μεταφέρει ομάδες ακυλίου από το κυτταρόπλασμα στη μιτοχονδριακή μήτρα, οδηγώντας στην οξείδωση των λιπαρών οξέων για την παραγωγή ενέργειας 55 .Σε συμφωνία με τα ευρήματά μας, μια πρόσφατη μελέτη εντόπισε επίσης παρόμοια προφίλ μεταβολισμού μεταξύ του μεταλλαγμένου EGFR και των όγκων άγριου τύπου EGFR, αναλύοντας το παγκόσμιο μεταβολίωμα 102 δειγμάτων ιστού αδενοκαρκινώματος πνεύμονα50.Είναι ενδιαφέρον ότι η περιεκτικότητα σε ακυλκαρνιτίνη βρέθηκε επίσης στην ομάδα μεταλλαγμένων EGFR.Επομένως, εάν οι αλλαγές στα επίπεδα ακυλκαρνιτίνης αντανακλούν μεταβολικές αλλαγές που προκαλούνται από EGFR και τις υποκείμενες μοριακές οδούς μπορεί να αξίζει περαιτέρω μελέτη.
Συμπερασματικά, η μελέτη μας καθιερώνει έναν μεταβολικό ταξινομητή ορού για τη διαφορική διάγνωση των πνευμονικών όζων και προτείνει μια ροή εργασίας που μπορεί να βελτιστοποιήσει την αξιολόγηση κινδύνου και να διευκολύνει την κλινική διαχείριση με βάση τον έλεγχο αξονικής τομογραφίας.
Αυτή η μελέτη εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας του Πανεπιστημιακού Αντικαρκινικού Νοσοκομείου Sun Yat-sen, το Πρώτο Συνεργαζόμενο Νοσοκομείο του Πανεπιστημίου Sun Yat-sen και την Επιτροπή Δεοντολογίας του Πανεπιστημιακού Αντικαρκινικού Νοσοκομείου Zhengzhou.Στις ομάδες ανακάλυψης και εσωτερικής επικύρωσης, συλλέχθηκαν 174 οροί από υγιή άτομα και 244 οροί από καλοήθεις όζους από άτομα που υποβάλλονταν σε ετήσιες ιατρικές εξετάσεις στο Τμήμα Ελέγχου και Πρόληψης Καρκίνου, στο Κέντρο Καρκίνου του Πανεπιστημίου Sun Yat-sen και 166 καλοήθεις όζοι.ορρός.Τα αδενοκαρκινώματα του πνεύμονα σταδίου Ι συλλέχθηκαν από το Κέντρο Καρκίνου του Πανεπιστημίου Sun Yat-sen.Στην κοόρτη εξωτερικής επικύρωσης, υπήρχαν 48 περιπτώσεις καλοήθων οζιδίων, 39 περιπτώσεις αδενοκαρκινώματος πνεύμονα σταδίου Ι από το Πρώτο Συνεργαζόμενο Νοσοκομείο του Πανεπιστημίου Sun Yat-sen και 24 περιπτώσεις αδενοκαρκινώματος πνεύμονα σταδίου Ι από το Νοσοκομείο Καρκίνου του Zhengzhou.Το Κέντρο Καρκίνου του Πανεπιστημίου Sun Yat-sen συνέλεξε επίσης 16 περιπτώσεις ακανθοκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα σταδίου Ι για να ελέγξει τη διαγνωστική ικανότητα του καθιερωμένου μεταβολικού ταξινομητή (τα χαρακτηριστικά του ασθενούς φαίνονται στον Συμπληρωματικό Πίνακα 5).Δείγματα από την κοόρτη ανακάλυψης και την εσωτερική κοόρτη επικύρωσης συλλέχθηκαν μεταξύ Ιανουαρίου 2018 και Μαΐου 2020. Δείγματα για την κοόρτη εξωτερικής επικύρωσης συλλέχθηκαν μεταξύ Αυγούστου 2021 και Οκτωβρίου 2022. Για να ελαχιστοποιηθεί η μεροληψία φύλου, αντιστοιχίστηκαν περίπου ίσος αριθμός περιπτώσεων ανδρών και γυναικών σε κάθε λόχος στρατού.Ομάδα Discovery και Ομάδα Εσωτερικής Αναθεώρησης.Το φύλο των συμμετεχόντων καθορίστηκε με βάση την αυτοαναφορά.Ελήφθη ενημερωμένη συγκατάθεση από όλους τους συμμετέχοντες και δεν δόθηκε αποζημίωση.Τα άτομα με καλοήθεις όζους ήταν αυτά με σταθερή βαθμολογία αξονικής τομογραφίας στα 2 έως 5 χρόνια τη στιγμή της ανάλυσης, εκτός από 1 περίπτωση από το δείγμα εξωτερικής επικύρωσης, το οποίο συλλέχτηκε προεγχειρητικά και διαγνώστηκε ιστοπαθολογικά.Με εξαίρεση τη χρόνια βρογχίτιδα.Οι περιπτώσεις αδενοκαρκινώματος πνεύμονα συλλέχθηκαν πριν από την εκτομή του πνεύμονα και επιβεβαιώθηκαν με παθολογική διάγνωση.Δείγματα αίματος νηστείας συλλέχθηκαν σε σωληνάρια διαχωρισμού ορού χωρίς αντιπηκτικά.Τα δείγματα αίματος θρομβώθηκαν για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου και στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκαν στα 2851 χ g για 10 λεπτά στους 4°C για τη συλλογή του υπερκείμενου ορού.Δείγματα ορού καταψύχθηκαν στους -80°C μέχρι την εκχύλιση του μεταβολίτη.Το Τμήμα Πρόληψης Καρκίνου και Ιατρικής Εξέτασης του Κέντρου Καρκίνου του Πανεπιστημίου Sun Yat-sen συγκέντρωσε μια ομάδα ορού από 100 υγιείς δότες, συμπεριλαμβανομένων ίσου αριθμού ανδρών και γυναικών ηλικίας 40 έως 55 ετών.Ίσοι όγκοι από κάθε δείγμα δότη αναμίχθηκαν, η προκύπτουσα δεξαμενή κλασματοποιήθηκε και αποθηκεύτηκε στους -80°C.Το μείγμα ορού χρησιμοποιήθηκε ως υλικό αναφοράς για ποιοτικό έλεγχο και τυποποίηση δεδομένων.
Ο ορός αναφοράς και τα δείγματα δοκιμής αποψύχθηκαν και οι μεταβολίτες εκχυλίστηκαν χρησιμοποιώντας μια μέθοδο συνδυασμένης εκχύλισης (ΜΤΒΕ/μεθανόλη/νερό) 56 .Εν συντομία, 50 μl ορού αναμίχθηκαν με 225 μl παγωμένης μεθανόλης και 750 μl παγωμένου μεθυλτριτ-βουτυλαιθέρα (MTBE).Ανακατέψτε το μείγμα και επωάστε σε πάγο για 1 ώρα.Στη συνέχεια, τα δείγματα αναμίχθηκαν και αναμίχθηκαν με στροβιλισμό με 188 μl νερού ποιότητας MS που περιείχε εσωτερικά πρότυπα (13C-γαλακτικό, 13C3-πυροσταφυλικό, 13C-μεθειονίνη και 13C6-ισολευκίνη, που αγοράστηκαν από τα Cambridge Isotope Laboratories).Το μείγμα στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκε στα 15.000 × g για 10 λεπτά στους 4 °C και η κατώτερη φάση μεταφέρθηκε σε δύο σωλήνες (125 μL το καθένα) για ανάλυση LC-MS σε θετική και αρνητική λειτουργία.Τέλος, το δείγμα εξατμίστηκε μέχρι ξηρού σε συμπυκνωτή κενού υψηλής ταχύτητας.
Οι αποξηραμένοι μεταβολίτες ανασυστάθηκαν σε 120 μl ακετονιτριλίου 80%, στροβιλίστηκαν για 5 λεπτά και φυγοκεντρήθηκαν στα 15.000 × g για 10 λεπτά στους 4°C.Τα υπερκείμενα μεταφέρθηκαν σε κεχριμπαρένια γυάλινα φιαλίδια με μικροενθέματα για μεταβολομικές μελέτες.Μη στοχευμένη μεταβολομική ανάλυση σε μια πλατφόρμα υπερ-απόδοσης υγρής χρωματογραφίας-φασματομετρίας μάζας υψηλής ανάλυσης (UPLC-HRMS).Οι μεταβολίτες διαχωρίστηκαν χρησιμοποιώντας ένα σύστημα Dionex Ultimate 3000 UPLC και μια στήλη ACQUITY BEH Amide (2,1 × 100 mm, 1,7 μm, Waters).Στη λειτουργία θετικού ιόντος, οι κινητές φάσεις ήταν 95% (Α) και 50% ακετονιτρίλιο (Β), η καθεμία περιείχε 10 mmol/L οξικό αμμώνιο και 0,1% μυρμηκικό οξύ.Στην αρνητική λειτουργία, οι κινητές φάσεις Α και Β περιείχαν 95% και 50% ακετονιτρίλιο, αντίστοιχα, και οι δύο φάσεις περιείχαν 10 mmol/L οξικό αμμώνιο, pH = 9. Το πρόγραμμα βαθμίδωσης ήταν ως εξής: 0–0,5 λεπτά, 2% Β.0,5–12 λεπτά, 2–50% Β;12–14 λεπτά, 50–98% Β;14–16 λεπτά, 98% Β;16–16.1.min, 98 -2% B;16,1–20 λεπτά, 2% Β. Η στήλη διατηρήθηκε στους 40°C και το δείγμα στους 10°C στον αυτόματο δειγματολήπτη.Ο ρυθμός ροής ήταν 0,3 ml/min, ο όγκος έγχυσης ήταν 3 μl.Ένα φασματόμετρο μάζας Q-Exactive Orbitrap (Thermo Fisher Scientific) με πηγή ιονισμού ηλεκτροψεκασμού (ESI) λειτούργησε σε λειτουργία πλήρους σάρωσης και συνδυάστηκε με τη λειτουργία παρακολούθησης ddMS2 για τη συλλογή μεγάλων όγκων δεδομένων.Οι παράμετροι MS ορίστηκαν ως εξής: τάση ψεκασμού +3,8 kV/- 3,2 kV, τριχοειδική θερμοκρασία 320°C, προστατευτικό αέριο 40 arb, βοηθητικό αέριο 10 arb, θερμοκρασία θερμαντήρα ανιχνευτή 350°C, εύρος σάρωσης 70–1050 m/h, ανάλυση.70 000. Τα δεδομένα ελήφθησαν χρησιμοποιώντας το Xcalibur 4.1 (Thermo Fisher Scientific).
Για την αξιολόγηση της ποιότητας των δεδομένων, δημιουργήθηκαν δείγματα συγκεντρωτικού ποιοτικού ελέγχου (QC) αφαιρώντας κλάσματα 10 μL του υπερκειμένου από κάθε δείγμα.Έξι ενέσεις δειγμάτων ποιοτικού ελέγχου αναλύθηκαν στην αρχή της αναλυτικής ακολουθίας για την αξιολόγηση της σταθερότητας του συστήματος UPLC-MS.Στη συνέχεια, τα δείγματα ποιοτικού ελέγχου εισάγονται περιοδικά στην παρτίδα.Και οι 11 παρτίδες δειγμάτων ορού σε αυτή τη μελέτη αναλύθηκαν με LC-MS.Δείγματα ενός μείγματος δεξαμενής ορού από 100 υγιείς δότες χρησιμοποιήθηκαν ως υλικό αναφοράς σε αντίστοιχες παρτίδες για την παρακολούθηση της διαδικασίας εκχύλισης και την προσαρμογή για τα αποτελέσματα από παρτίδα σε παρτίδα.Η μη στοχευμένη μεταβολομική ανάλυση της κοόρτης ανακάλυψης, της κοόρτης εσωτερικής επικύρωσης και της κοόρτης εξωτερικής επικύρωσης πραγματοποιήθηκε στο Κέντρο Μεταβολομικής του Πανεπιστημίου Sun Yat-sen.Το εξωτερικό εργαστήριο του Κέντρου Ανάλυσης και Δοκιμών του Πανεπιστημίου Τεχνολογίας του Γκουανγκντόνγκ ανέλυσε επίσης 40 δείγματα από την εξωτερική κοόρτη για να ελέγξει την απόδοση του μοντέλου ταξινομητή.
Μετά την εκχύλιση και την ανασύσταση, μετρήθηκε η απόλυτη ποσοτικοποίηση των μεταβολιτών του ορού χρησιμοποιώντας φασματομετρία μάζας υπερυψηλής απόδοσης υγρής χρωματογραφίας-διαδοχικής φασματομετρίας μάζας (Agilent 6495 τριπλό τετραπολικό) με πηγή ιονισμού ηλεκτροψεκασμού (ESI) σε λειτουργία παρακολούθησης πολλαπλών αντιδράσεων (MRM).Μια στήλη ACQUITY BEH Amide (2,1 × 100 mm, 1,7 μm, Waters) χρησιμοποιήθηκε για τον διαχωρισμό των μεταβολιτών.Η κινητή φάση αποτελούνταν από 90% (Α) και 5% ακετονιτρίλιο (Β) με 10 mmol/L οξικό αμμώνιο και 0,1% διάλυμα αμμωνίας.Το πρόγραμμα κλίσης ήταν ως εξής: 0–1,5 min, 0% B;1,5–6,5 λεπτά, 0–15% Β;6,5–8 λεπτά, 15% Β;8–8,5 λεπτά, 15%–0% Β;8,5–11,5 λεπτά, 0%Β.Η στήλη διατηρήθηκε στους 40 °C και το δείγμα στους 10 °C στον αυτόματο δειγματολήπτη.Ο ρυθμός ροής ήταν 0,3 mL/min και ο όγκος έγχυσης ήταν 1 μL.Οι παράμετροι MS ορίστηκαν ως εξής: τριχοειδής τάση ±3,5 kV, πίεση νεφελοποιητή 35 psi, ροή αερίου περιβλήματος 12 L/min, θερμοκρασία αερίου περιβλήματος 350°C, θερμοκρασία αερίου ξήρανσης 250°C και ροή αερίου ξήρανσης 14 l/min.Οι μετατροπές MRM τρυπτοφάνης, πυροσταφυλικού, γαλακτικού, υποξανθίνης και ξανθίνης ήταν 205,0–187,9, 87,0–43,4, 89,0–43,3, 135,0–92,3 και 151,0–107.9 αντίστοιχα.Τα δεδομένα συλλέχθηκαν χρησιμοποιώντας Mass Hunter B.07.00 (Agilent Technologies).Για δείγματα ορού, η τρυπτοφάνη, το πυροσταφυλικό, το γαλακτικό, η υποξανθίνη και η ξανθίνη ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας καμπύλες βαθμονόμησης τυπικών διαλυμάτων μείγματος.Για δείγματα κυττάρων, η περιεκτικότητα σε τρυπτοφάνη κανονικοποιήθηκε στο εσωτερικό πρότυπο και τη μάζα κυτταρικής πρωτεΐνης.
Εκχύλιση κορυφής (m/z και χρόνος κατακράτησης (RT)) πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας Compound Discovery 3.1 και TraceFinder 4.0 (Thermo Fisher Scientific).Για να εξαλειφθούν οι πιθανές διαφορές μεταξύ των παρτίδων, κάθε χαρακτηριστική κορυφή του δείγματος δοκιμής διαιρέθηκε με τη χαρακτηριστική κορυφή του υλικού αναφοράς από την ίδια παρτίδα για να ληφθεί η σχετική αφθονία.Οι σχετικές τυπικές αποκλίσεις των εσωτερικών προτύπων πριν και μετά την τυποποίηση φαίνονται στον Συμπληρωματικό Πίνακα 6. Οι διαφορές μεταξύ των δύο ομάδων χαρακτηρίστηκαν από λανθασμένο ποσοστό ανακάλυψης (FDR<0,05, δοκιμασία υπογεγραμμένης κατάταξης Wilcoxon) και αλλαγή αναδίπλωσης (>1,2 ή <0,83).Τα ακατέργαστα δεδομένα MS των εξαγόμενων χαρακτηριστικών και τα δεδομένα MS που έχουν διορθωθεί με ορό αναφοράς εμφανίζονται στα Συμπληρωματικά Δεδομένα 1 και Συμπληρωματικά Δεδομένα 2, αντίστοιχα.Ο σχολιασμός κορυφής πραγματοποιήθηκε βάσει τεσσάρων καθορισμένων επιπέδων ταυτοποίησης, συμπεριλαμβανομένων των αναγνωρισμένων μεταβολιτών, των υποτιθέμενων σχολιασμένων ενώσεων, των υποθετικά χαρακτηρισμένων κατηγοριών ενώσεων και των άγνωστων ενώσεων 22 .Με βάση τις αναζητήσεις στη βάση δεδομένων στο Compound Discovery 3.1 (mzCloud, HMDB, Chemspider), βιολογικές ενώσεις με MS/MS που ταιριάζουν με επικυρωμένα πρότυπα ή σχολιασμούς ακριβούς αντιστοίχισης στο mzCloud (βαθμολογία > 85) ή στο Chemspider επιλέχθηκαν τελικά ως ενδιάμεσα μεταξύ του διαφορικού μεταβολισμού.Οι σχολιασμοί αιχμής για κάθε χαρακτηριστικό περιλαμβάνονται στα Συμπληρωματικά Δεδομένα 3. Το MetaboAnalyst 5.0 χρησιμοποιήθηκε για μονομεταβλητή ανάλυση της αφθονίας μεταβολιτών κανονικοποιημένου αθροίσματος.Το MetaboAnalyst 5.0 αξιολόγησε επίσης την ανάλυση εμπλουτισμού της οδού KEGG με βάση σημαντικά διαφορετικούς μεταβολίτες.Η ανάλυση κύριου συστατικού (PCA) και η ανάλυση διάκρισης μερικών ελαχίστων τετραγώνων (PLS-DA) αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το πακέτο λογισμικού ropls (v.1.26.4) με κανονικοποίηση στοίβας και αυτόματη κλιμάκωση.Το βέλτιστο μοντέλο βιοδείκτη μεταβολίτη για την πρόβλεψη κακοήθειας οζιδίων δημιουργήθηκε χρησιμοποιώντας δυαδική λογιστική παλινδρόμηση με χειριστή ελάχιστης απόλυτης συρρίκνωσης και επιλογής (LASSO, R πακέτο v.4.1-3).Η απόδοση του μοντέλου διάκρισης στα σύνολα ανίχνευσης και επικύρωσης χαρακτηρίστηκε με εκτίμηση της AUC με βάση την ανάλυση ROC σύμφωνα με το πακέτο pROC (v.1.18.0.).Η βέλτιστη αποκοπή πιθανότητας λήφθηκε με βάση τον μέγιστο δείκτη Youden του μοντέλου (ευαισθησία + ειδικότητα – 1).Δείγματα με τιμές μικρότερες ή μεγαλύτερες από τον ουδό θα προβλεφθούν ως καλοήθεις όζοι και αδενοκαρκίνωμα πνεύμονα, αντίστοιχα.
Κύτταρα Α549 (#CCL-185, American Type Culture Collection) αναπτύχθηκαν σε μέσο F-12K που περιέχει 10% FBS.Σύντομες αλληλουχίες RNA (shRNA) φουρκέτας που στοχεύουν SLC7A5 και μη στοχευόμενος έλεγχος (NC) εισήχθησαν στον φακοϊικό φορέα pLKO.1-puro.Οι αντινοηματικές αλληλουχίες του shSLC7A5 είναι οι εξής: Sh1 (5'-GGAGAAACCTGATGAACAGTT-3'), Sh2 (5'-GCCGTGGACTTCGGGAACTAT-3').Αντισώματα έναντι του SLC7A5 (#5347) και της τουμπουλίνης (#2148) αγοράστηκαν από την Cell Signaling Technology.Αντισώματα έναντι του SLC7A5 και της τουμπουλίνης χρησιμοποιήθηκαν σε αραίωση 1:1000 για ανάλυση στυπώματος Western.
Το Seahorse XF Glycolytic Stress Test μετρά τα επίπεδα εξωκυτταρικής οξίνισης (ECAR).Στη δοκιμασία, γλυκόζη, ολιγομυκίνη Α και 2-DG χορηγήθηκαν διαδοχικά για να δοκιμαστεί η κυτταρική γλυκολυτική ικανότητα όπως μετρήθηκε με ECAR.
Κύτταρα Α549 επιμολυνθέντα με μάρτυρα μη στόχευσης (NC) και shSLC7A5 (Sh1, Sh2) επιστρώθηκαν όλη τη νύχτα σε δίσκους διαμέτρου 10 cm.Οι κυτταρικοί μεταβολίτες εκχυλίστηκαν με 1 ml παγωμένης υδατικής μεθανόλης 80%.Τα κύτταρα στο διάλυμα μεθανόλης αποξέστηκαν, συλλέχθηκαν σε νέο σωλήνα και φυγοκεντρήθηκαν στα 15.000 χ g για 15 λεπτά στους 4°C.Συλλέξτε 800 μl υπερκειμένου και στεγνώστε χρησιμοποιώντας συμπυκνωτή κενού υψηλής ταχύτητας.Τα αποξηραμένα σφαιρίδια μεταβολίτη στη συνέχεια αναλύθηκαν για επίπεδα τρυπτοφάνης χρησιμοποιώντας LC-MS/MS όπως περιγράφεται παραπάνω.Τα επίπεδα κυτταρικού NAD(H) σε κύτταρα A549 (NC και shSLC7A5) μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα ποσοτικό κιτ χρωματομετρίας NAD+/NADH (#K337, BioVision) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.Τα επίπεδα πρωτεΐνης μετρήθηκαν για κάθε δείγμα για να ομαλοποιηθεί η ποσότητα των μεταβολιτών.
Δεν χρησιμοποιήθηκαν στατιστικές μέθοδοι για τον προκαταρκτικό προσδιορισμό του μεγέθους του δείγματος.Προηγούμενες μελέτες μεταβολομικής με στόχο την ανακάλυψη βιοδεικτών15,18 έχουν θεωρηθεί ως σημεία αναφοράς για τον προσδιορισμό του μεγέθους και σε σύγκριση με αυτές τις αναφορές, το δείγμα μας ήταν επαρκές.Κανένα δείγμα δεν εξαιρέθηκε από τη κοόρτη της μελέτης.Τα δείγματα ορού κατανεμήθηκαν τυχαία σε μια ομάδα ανακάλυψης (306 περιπτώσεις, 74,6%) και σε μια ομάδα εσωτερικής επικύρωσης (104 περιπτώσεις, 25,4%) για μη στοχευμένες μελέτες μεταβολομικής.Επιλέξαμε επίσης τυχαία 70 περιπτώσεις από κάθε ομάδα από το σύνολο ανακάλυψης για στοχευμένες μελέτες μεταβολομικής.Οι ερευνητές τυφλώθηκαν ως προς την ομαδική ανάθεση κατά τη συλλογή και ανάλυση δεδομένων LC-MS.Οι στατιστικές αναλύσεις μεταβολομικών δεδομένων και πειραμάτων κυττάρων περιγράφονται στις αντίστοιχες ενότητες Αποτελέσματα, Υπόμνημα Εικόνων και Μέθοδοι.Η ποσοτικοποίηση της κυτταρικής τρυπτοφάνης, NADT και γλυκολυτικής δραστηριότητας πραγματοποιήθηκε τρεις φορές ανεξάρτητα με πανομοιότυπα αποτελέσματα.
Για περισσότερες πληροφορίες σχετικά με το σχεδιασμό της μελέτης, ανατρέξτε στην Περίληψη της αναφοράς Natural Portfolio που σχετίζεται με αυτό το άρθρο.
Τα ακατέργαστα δεδομένα MS των εξαγόμενων χαρακτηριστικών και τα κανονικοποιημένα δεδομένα MS του ορού αναφοράς εμφανίζονται στα Συμπληρωματικά Δεδομένα 1 και Συμπληρωματικά Δεδομένα 2, αντίστοιχα.Οι σχολιασμοί αιχμής για διαφορικά χαρακτηριστικά παρουσιάζονται στα Συμπληρωματικά Δεδομένα 3. Μπορείτε να λάβετε το σύνολο δεδομένων LUAD TCGA από τη διεύθυνση https://portal.gdc.cancer.gov/.Τα δεδομένα εισόδου για τη γραφική παράσταση του γραφήματος παρέχονται στα δεδομένα πηγής.Τα δεδομένα πηγής παρέχονται για αυτό το άρθρο.
National Lung Screening Study Group, κ.λπ. Μείωση της θνησιμότητας από καρκίνο του πνεύμονα με αξονική τομογραφία χαμηλής δόσης.Βόρεια Αγγλία.J. Med.365, 395–409 (2011).
Kramer, BS, Berg, KD, Aberle, DR and Prophet, PC Προσυμπτωματικός έλεγχος καρκίνου του πνεύμονα με χρήση ελικοειδούς αξονικής τομογραφίας χαμηλής δόσης: αποτελέσματα από την Εθνική Μελέτη Προσυμπτωματικού Ελέγχου Πνευμόνων (NLST).J. Med.Screen 18, 109–111 (2011).
De Koning, HJ, et al.Μείωση της θνησιμότητας από καρκίνο του πνεύμονα με ογκομετρικό έλεγχο CT σε μια τυχαιοποιημένη δοκιμή.Βόρεια Αγγλία.J. Med.382, 503–513 (2020).
Ώρα δημοσίευσης: Σεπ-18-2023