Η διαφορική διάγνωση πνευμονικών οζιδίων που εντοπίζονται με αξονική τομογραφία (CT) παραμένει μια πρόκληση στην κλινική πράξη. Εδώ, χαρακτηρίζουμε το συνολικό μεταβολικό σύνολο 480 δειγμάτων ορού, συμπεριλαμβανομένων υγιών μαρτύρων, καλοήθων πνευμονικών οζιδίων και αδενοκαρκινώματος πνεύμονα σταδίου Ι. Τα αδενοκαρκινώματα εμφανίζουν μοναδικά μεταβολομικά προφίλ, ενώ τα καλοήθη οζίδια και τα υγιή άτομα έχουν υψηλή ομοιότητα στα μεταβολομικά προφίλ. Στην ομάδα ανακάλυψης (n = 306), εντοπίστηκε ένα σύνολο 27 μεταβολιτών για τη διαφοροποίηση μεταξύ καλοήθων και κακοήθων οζιδίων. Η AUC του διακριτικού μοντέλου στις ομάδες εσωτερικής επικύρωσης (n = 104) και εξωτερικής επικύρωσης (n = 111) ήταν 0,915 και 0,945, αντίστοιχα. Η ανάλυση της οδού αποκάλυψε αυξημένους γλυκολυτικούς μεταβολίτες που σχετίζονται με μειωμένη τρυπτοφάνη στον ορό του αδενοκαρκινώματος πνεύμονα σε σύγκριση με καλοήθη οζίδια και υγιείς μάρτυρες, και υπέδειξε ότι η πρόσληψη τρυπτοφάνης προάγει τη γλυκόλυση σε κύτταρα καρκίνου του πνεύμονα. Η μελέτη μας υπογραμμίζει την αξία των βιοδεικτών μεταβολιτών ορού στην αξιολόγηση του κινδύνου πνευμονικών οζιδίων που ανιχνεύονται με CT.
Η έγκαιρη διάγνωση είναι κρίσιμη για τη βελτίωση των ποσοστών επιβίωσης των ασθενών με καρκίνο. Τα αποτελέσματα της Εθνικής Μελέτης Προσυμπτωματικού Ελέγχου Καρκίνου του Πνεύμονα (NLST) των ΗΠΑ και της Ευρωπαϊκής Μελέτης NELSON έδειξαν ότι ο έλεγχος με αξονική τομογραφία χαμηλής δόσης (LDCT) μπορεί να μειώσει σημαντικά τη θνησιμότητα από καρκίνο του πνεύμονα σε ομάδες υψηλού κινδύνου1,2,3. Από την ευρεία χρήση της LDCT για τον έλεγχο του καρκίνου του πνεύμονα, η συχνότητα εμφάνισης τυχαίων ακτινογραφικών ευρημάτων ασυμπτωματικών πνευμονικών οζιδίων συνέχισε να αυξάνεται4. Οι πνευμονικοί οζίδια ορίζονται ως εστιακές θολερότητες διαμέτρου έως 3 cm5. Αντιμετωπίζουμε δυσκολίες στην αξιολόγηση της πιθανότητας κακοήθειας και στην αντιμετώπιση του μεγάλου αριθμού πνευμονικών οζιδίων που ανιχνεύονται τυχαία στην LDCT. Οι περιορισμοί της αξονικής τομογραφίας μπορούν να οδηγήσουν σε συχνές εξετάσεις παρακολούθησης και ψευδώς θετικά αποτελέσματα, οδηγώντας σε περιττή παρέμβαση και υπερβολική θεραπεία6. Επομένως, υπάρχει ανάγκη ανάπτυξης αξιόπιστων και χρήσιμων βιοδεικτών για την ορθή αναγνώριση του καρκίνου του πνεύμονα στα πρώιμα στάδια και τη διαφοροποίηση των περισσότερων καλοήθων οζιδίων κατά την αρχική ανίχνευση7.
Η ολοκληρωμένη μοριακή ανάλυση του αίματος (ορός, πλάσμα, μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος), συμπεριλαμβανομένης της γονιδιωματικής, της πρωτεωμικής ή της μεθυλίωσης του DNA8,9,10, έχει οδηγήσει σε αυξανόμενο ενδιαφέρον για την ανακάλυψη διαγνωστικών βιοδεικτών για τον καρκίνο του πνεύμονα. Εν τω μεταξύ, οι μεταβολικές προσεγγίσεις μετρούν τα κυτταρικά τελικά προϊόντα που επηρεάζονται από ενδογενείς και εξωγενείς δράσεις και ως εκ τούτου εφαρμόζονται για την πρόβλεψη της έναρξης και της έκβασης της νόσου. Η υγρή χρωματογραφία-φασματομετρία μάζας tandem (LC-MS) είναι μια ευρέως χρησιμοποιούμενη μέθοδος για μεταβολικές μελέτες λόγω της υψηλής ευαισθησίας και του μεγάλου δυναμικού εύρους, η οποία μπορεί να καλύψει μεταβολίτες με διαφορετικές φυσικοχημικές ιδιότητες11,12,13. Παρόλο που η συνολική μεταβολική ανάλυση πλάσματος/ορού έχει χρησιμοποιηθεί για τον εντοπισμό βιοδεικτών που σχετίζονται με τη διάγνωση του καρκίνου του πνεύμονα14,15,16,17 και την αποτελεσματικότητα της θεραπείας,18 οι ταξινομητές μεταβολιτών ορού για τη διάκριση μεταξύ καλοήθων και κακοήθων πνευμονικών οζιδίων παραμένουν προς μελέτη. -μαζική έρευνα.
Το αδενοκαρκίνωμα και το πλακώδες καρκίνωμα είναι οι δύο κύριοι υποτύποι του μη μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα (NSCLC). Διάφορες εξετάσεις διαλογής με αξονική τομογραφία (CT) δείχνουν ότι το αδενοκαρκίνωμα είναι ο πιο συνηθισμένος ιστολογικός τύπος καρκίνου του πνεύμονα1,19,20,21. Σε αυτή τη μελέτη, χρησιμοποιήσαμε υγρή χρωματογραφία υπεραπόδοσης-φασματομετρία μάζας υψηλής ανάλυσης (UPLC-HRMS) για να πραγματοποιήσουμε μεταβολομική ανάλυση σε συνολικά 695 δείγματα ορού, συμπεριλαμβανομένων υγιών μαρτύρων, καλοήθων πνευμονικών οζιδίων και CT ≤3 cm που ανιχνεύθηκαν. Διαλογή για αδενοκαρκίνωμα πνεύμονα σταδίου Ι. Εντοπίσαμε μια ομάδα μεταβολιτών ορού που διακρίνουν το αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα από τους καλοήθεις οζίδια και τους υγιείς μάρτυρες. Η ανάλυση εμπλουτισμού της οδού αποκάλυψε ότι ο μη φυσιολογικός μεταβολισμός της τρυπτοφάνης και της γλυκόζης είναι συχνές αλλοιώσεις στο αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα σε σύγκριση με τους καλοήθεις οζίδια και τους υγιείς μάρτυρες. Τέλος, δημιουργήσαμε και επικυρώσαμε έναν μεταβολικό ταξινομητή ορού με υψηλή εξειδίκευση και ευαισθησία για τη διάκριση μεταξύ κακοήθων και καλοήθων πνευμονικών οζιδίων που ανιχνεύονται με LDCT, η οποία μπορεί να βοηθήσει στην έγκαιρη διαφορική διάγνωση και την αξιολόγηση κινδύνου.
Στην παρούσα μελέτη, συλλέχθηκαν αναδρομικά δείγματα ορού αντίστοιχης ηλικίας και φύλου από 174 υγιείς μάρτυρες, 292 ασθενείς με καλοήθη πνευμονικά οζίδια και 229 ασθενείς με αδενοκαρκίνωμα πνεύμονα σταδίου Ι. Τα δημογραφικά χαρακτηριστικά των 695 ατόμων παρουσιάζονται στον Συμπληρωματικό Πίνακα 1.
Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1α, συνολικά 480 δείγματα ορού, συμπεριλαμβανομένων 174 υγιών μαρτύρων (HC), 170 καλοήθων οζιδίων (BN) και 136 δειγμάτων αδενοκαρκινώματος πνεύμονα (LA) σταδίου Ι, συλλέχθηκαν στο Κέντρο Καρκίνου του Πανεπιστημίου Sun Yat-sen. Ομάδα ανακάλυψης για μη στοχευμένο μεταβολομικό προφίλ χρησιμοποιώντας υγρή χρωματογραφία υπεραπόδοσης-φασματομετρία μάζας υψηλής ανάλυσης (UPLC-HRMS). Όπως φαίνεται στο Συμπληρωματικό Σχήμα 1, εντοπίστηκαν διαφορικοί μεταβολίτες μεταξύ LA και HC, LA και BN για τη δημιουργία ενός μοντέλου ταξινόμησης και την περαιτέρω διερεύνηση της ανάλυσης διαφορικών οδών. 104 δείγματα που συλλέχθηκαν από το Κέντρο Καρκίνου του Πανεπιστημίου Sun Yat-sen και 111 δείγματα που συλλέχθηκαν από δύο άλλα νοσοκομεία υποβλήθηκαν σε εσωτερική και εξωτερική επικύρωση, αντίστοιχα.
α Πληθυσμός μελέτης στην ομάδα ανακάλυψης που υποβλήθηκε σε παγκόσμια μεταβολομική ανάλυση ορού χρησιμοποιώντας υγρή χρωματογραφία υπεραπόδοσης-φασματομετρία μάζας υψηλής ανάλυσης (UPLC-HRMS). β Μερική διακριτική ανάλυση ελαχίστων τετραγώνων (PLS-DA) του συνολικού μεταβολικού συλλόγου 480 δειγμάτων ορού από την ομάδα μελέτης, συμπεριλαμβανομένων υγιών μαρτύρων (HC, n = 174), καλοήθων οζιδίων (BN, n = 170) και αδενοκαρκινώματος πνεύμονα σταδίου Ι (Λος Άντζελες, n = 136). +ESI, θετικός τρόπος ιονισμού ηλεκτροψεκασμού, -ESI, αρνητικός τρόπος ιονισμού ηλεκτροψεκασμού. γ–ε Μεταβολίτες με σημαντικά διαφορετικές αφθονίες σε δύο δεδομένες ομάδες (αμφίπλευρο δοκιμασία κατάταξης Wilcoxon με πρόσημο, τιμή p προσαρμοσμένη κατά ποσοστό ψευδούς ανακάλυψης, FDR <0,05) εμφανίζονται με κόκκινο (αλλαγή φορές > 1,2) και μπλε (αλλαγή φορές < 0,83). ) φαίνεται στο γράφημα του ηφαιστείου. στ Ιεραρχικός χάρτης θερμότητας ομαδοποίησης που δείχνει σημαντικές διαφορές στον αριθμό των σχολιασμένων μεταβολιτών μεταξύ LA και BN. Τα δεδομένα πηγής παρέχονται με τη μορφή αρχείων δεδομένων πηγής.
Το συνολικό μεταβολικό σύνολο ορού των 174 HC, 170 BN και 136 LA στην ομάδα ανακάλυψης αναλύθηκε χρησιμοποιώντας ανάλυση UPLC-HRMS. Αρχικά, δείχνουμε ότι τα δείγματα ποιοτικού ελέγχου (QC) συγκεντρώνονται στενά στο κέντρο ενός μοντέλου μη επιβλεπόμενης ανάλυσης κύριων συστατικών (PCA), επιβεβαιώνοντας τη σταθερότητα της απόδοσης της τρέχουσας μελέτης (Συμπληρωματικό Σχήμα 2).
Όπως φαίνεται στην μερική διακριτική ανάλυση ελαχίστων τετραγώνων (PLS-DA) στο Σχήμα 1b, διαπιστώσαμε ότι υπήρχαν σαφείς διαφορές μεταξύ LA και BN, LA και HC σε θετικούς (+ESI) και αρνητικούς (-ESI) τρόπους ιονισμού ηλεκτροψεκασμού. Ωστόσο, δεν βρέθηκαν σημαντικές διαφορές μεταξύ BN και HC σε συνθήκες +ESI και -ESI.
Βρήκαμε 382 διαφορικά χαρακτηριστικά μεταξύ LA και HC, 231 διαφορικά χαρακτηριστικά μεταξύ LA και BN και 95 διαφορικά χαρακτηριστικά μεταξύ BN και HC (δοκιμασία κατάταξης Wilcoxon με προσήμανση, FDR <0,05 και πολλαπλή αλλαγή >1,2 ή <0,83) (Σχήμα .1c-e). . Οι κορυφές σχολιάστηκαν περαιτέρω (Συμπληρωματικά Δεδομένα 3) σε σχέση με μια βάση δεδομένων (βιβλιοθήκη mzCloud/HMDB/Chemspider) με τιμή m/z, χρόνο κατακράτησης και αναζήτηση φάσματος μάζας κατακερματισμού (λεπτομέρειες που περιγράφονται στην ενότητα Μέθοδοι) 22. Τέλος, εντοπίστηκαν 33 και 38 σχολιασμένοι μεταβολίτες με σημαντικές διαφορές στην αφθονία για LA έναντι BN (Σχήμα 1f και Συμπληρωματικός Πίνακας 2) και LA έναντι HC (Συμπληρωματικό Σχήμα 3 και Συμπληρωματικός Πίνακας 2), αντίστοιχα. Αντίθετα, εντοπίστηκαν μόνο 3 μεταβολίτες με σημαντικές διαφορές στην αφθονία στο BN και το HC (Συμπληρωματικός Πίνακας 2), σύμφωνα με την επικάλυψη μεταξύ BN και HC στο PLS-DA. Αυτοί οι διαφορικοί μεταβολίτες καλύπτουν ένα ευρύ φάσμα βιοχημικών (Συμπληρωματικό Σχήμα 4). Συνολικά, αυτά τα αποτελέσματα καταδεικνύουν σημαντικές αλλαγές στο μεταβολικό σύνολο ορού που αντικατοπτρίζουν τον κακοήθη μετασχηματισμό του καρκίνου του πνεύμονα σε πρώιμο στάδιο σε σύγκριση με καλοήθη οζίδια του πνεύμονα ή υγιή άτομα. Εν τω μεταξύ, η ομοιότητα του μεταβολικού σύνολου ορού του BN και του HC υποδηλώνει ότι τα καλοήθη πνευμονικά οζίδια μπορεί να μοιράζονται πολλά βιολογικά χαρακτηριστικά με υγιή άτομα. Δεδομένου ότι οι μεταλλάξεις του γονιδίου του υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR) είναι συχνές στον υποτύπο 23 του αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα, επιδιώξαμε να προσδιορίσουμε την επίδραση των μεταλλάξεων οδηγών στο μεταβολικό σύνολο ορού. Στη συνέχεια, αναλύσαμε το συνολικό μεταβολικό προφίλ 72 περιπτώσεων με κατάσταση EGFR στην ομάδα του αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα. Είναι ενδιαφέρον ότι βρήκαμε συγκρίσιμα προφίλ μεταξύ ασθενών με μεταλλαγμένο EGFR (n = 41) και ασθενών άγριου τύπου EGFR (n = 31) στην ανάλυση PCA (Συμπληρωματικό Σχήμα 5α). Ωστόσο, εντοπίσαμε 7 μεταβολίτες των οποίων η αφθονία μεταβλήθηκε σημαντικά σε ασθενείς με μετάλλαξη EGFR σε σύγκριση με ασθενείς με EGFR άγριου τύπου (t test, p < 0,05 και αλλαγή φορές > 1,2 ή < 0,83) (Συμπληρωματικό Σχήμα 5b). Η πλειονότητα αυτών των μεταβολιτών (5 από τους 7) είναι ακυλοκαρνιτίνες, οι οποίες παίζουν σημαντικό ρόλο στις οδούς οξείδωσης λιπαρών οξέων.
Όπως απεικονίζεται στη ροή εργασίας που φαίνεται στο Σχήμα 2α, οι βιοδείκτες για την ταξινόμηση των οζιδίων ελήφθησαν χρησιμοποιώντας τους τελεστές ελάχιστης απόλυτης συρρίκνωσης και επιλογή με βάση 33 διαφορικούς μεταβολίτες που εντοπίστηκαν στο LA (n = 136) και στο BN (n = 170). Βέλτιστος συνδυασμός μεταβλητών (LASSO) – μοντέλο δυαδικής λογιστικής παλινδρόμησης. Χρησιμοποιήθηκε δεκαπλάσια διασταυρούμενη επικύρωση για τον έλεγχο της αξιοπιστίας του μοντέλου. Η επιλογή μεταβλητών και η κανονικοποίηση παραμέτρων ρυθμίζονται με μια ποινή μεγιστοποίησης πιθανοφάνειας με την παράμετρο λ24. Η συνολική μεταβολομική ανάλυση πραγματοποιήθηκε περαιτέρω ανεξάρτητα στις ομάδες εσωτερικής επικύρωσης (n = 104) και εξωτερικής επικύρωσης (n = 111) για να ελεγχθεί η απόδοση ταξινόμησης του διακριτικού μοντέλου. Ως αποτέλεσμα, 27 μεταβολίτες στο σύνολο ανακαλύψεων αναγνωρίστηκαν ως το καλύτερο διακριτικό μοντέλο με τη μεγαλύτερη μέση τιμή AUC (Εικ. 2β), μεταξύ των οποίων 9 είχαν αυξημένη δραστηριότητα και 18 μειωμένη δραστηριότητα στο LA σε σύγκριση με το BN (Εικ. 2γ).
Ροή εργασίας για την κατασκευή ενός ταξινομητή πνευμονικών οζιδίων, συμπεριλαμβανομένης της επιλογής του καλύτερου πάνελ μεταβολιτών ορού στο σύνολο ανακάλυψης χρησιμοποιώντας ένα δυαδικό λογιστικό μοντέλο παλινδρόμησης μέσω δεκαπλάσιας διασταυρούμενης επικύρωσης και αξιολόγησης της προγνωστικής απόδοσης σε εσωτερικά και εξωτερικά σύνολα επικύρωσης. β Στατιστικά στοιχεία διασταυρούμενης επικύρωσης του μοντέλου παλινδρόμησης LASSO για την επιλογή μεταβολικών βιοδεικτών. Οι αριθμοί που δίνονται παραπάνω αντιπροσωπεύουν τον μέσο αριθμό βιοδεικτών που επιλέχθηκαν σε ένα δεδομένο λ. Η κόκκινη διακεκομμένη γραμμή αντιπροσωπεύει τη μέση τιμή AUC στο αντίστοιχο λάμδα. Οι γκρι γραμμές σφάλματος αντιπροσωπεύουν τις ελάχιστες και μέγιστες τιμές AUC. Η διακεκομμένη γραμμή υποδεικνύει το καλύτερο μοντέλο με τους 27 επιλεγμένους βιοδείκτες. AUC, περιοχή κάτω από την καμπύλη χαρακτηριστικών λειτουργίας δέκτη (ROC). γ Αλλαγές πτυχώσεων 27 επιλεγμένων μεταβολιτών στην ομάδα LA σε σύγκριση με την ομάδα BN στην ομάδα ανακάλυψης. Κόκκινη στήλη - ενεργοποίηση. Η μπλε στήλη είναι μια μείωση. d–f Καμπύλες χαρακτηριστικών λειτουργίας δέκτη (ROC) που δείχνουν την ισχύ του διακριτικού μοντέλου με βάση 27 συνδυασμούς μεταβολιτών στα σύνολα επικύρωσης ανακάλυψης, εσωτερικής και εξωτερικής επικύρωσης. Τα δεδομένα πηγής παρέχονται με τη μορφή αρχείων δεδομένων πηγής.
Δημιουργήθηκε ένα μοντέλο πρόβλεψης με βάση τους σταθμισμένους συντελεστές παλινδρόμησης αυτών των 27 μεταβολιτών (Συμπληρωματικός Πίνακας 3). Η ανάλυση ROC με βάση αυτούς τους 27 μεταβολίτες απέδωσε τιμή περιοχής κάτω από την καμπύλη (AUC) 0,933, ευαισθησία ομάδας ανακάλυψης ήταν 0,868 και ειδικότητα 0,859 (Εικ. 2δ). Εν τω μεταξύ, μεταξύ των 38 σχολιασμένων διαφορικών μεταβολιτών μεταξύ LA και HC, ένα σύνολο 16 μεταβολιτών πέτυχε AUC 0,902 με ευαισθησία 0,801 και ειδικότητα 0,856 στη διάκριση LA από HC (Συμπληρωματικό Σχήμα 6α-γ). Συγκρίθηκαν επίσης τιμές AUC που βασίζονται σε διαφορετικά όρια αλλαγής πτυχής για διαφορικούς μεταβολίτες. Διαπιστώσαμε ότι το μοντέλο ταξινόμησης είχε την καλύτερη απόδοση στη διάκριση μεταξύ LA και BN (HC) όταν το επίπεδο αλλαγής πτυχής ορίστηκε σε 1,2 έναντι 1,5 ή 2,0 (Συμπληρωματικό Σχήμα 7α,β). Το μοντέλο ταξινόμησης, που βασίζεται σε 27 ομάδες μεταβολιτών, επικυρώθηκε περαιτέρω σε εσωτερικές και εξωτερικές ομάδες. Η AUC ήταν 0,915 (ευαισθησία 0,867, ειδικότητα 0,811) για την εσωτερική επικύρωση και 0,945 (ευαισθησία 0,810, ειδικότητα 0,979) για την εξωτερική επικύρωση (Εικ. 2ε, στ). Για την αξιολόγηση της διεργαστηριακής αποτελεσματικότητας, 40 δείγματα από την εξωτερική ομάδα αναλύθηκαν σε εξωτερικό εργαστήριο όπως περιγράφεται στην ενότητα Μέθοδοι. Η ακρίβεια ταξινόμησης πέτυχε AUC 0,925 (Συμπληρωματικό Σχήμα 8). Επειδή το πλακώδες καρκίνωμα του πνεύμονα (LUSC) είναι ο δεύτερος πιο συχνός υποτύπος μη μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα (NSCLC) μετά το αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα (LUAD), εξετάσαμε επίσης την επικυρωμένη πιθανή χρησιμότητα των μεταβολικών προφίλ. BN και 16 περιπτώσεις LUSC. Η AUC διάκρισης μεταξύ LUSC και BN ήταν 0,776 (Συμπληρωματικό Σχήμα 9), υποδεικνύοντας χειρότερη ικανότητα σε σύγκριση με τη διάκριση μεταξύ LUAD και BN.
Μελέτες έχουν δείξει ότι το μέγεθος των οζιδίων στις εικόνες CT συσχετίζεται θετικά με την πιθανότητα κακοήθειας και παραμένει ένας σημαντικός καθοριστικός παράγοντας για τη θεραπεία των οζιδίων25,26,27. Η ανάλυση δεδομένων από τη μεγάλη ομάδα της μελέτης διαλογής NELSON έδειξε ότι ο κίνδυνος κακοήθειας σε άτομα με λεμφαδένες <5 mm ήταν ακόμη παρόμοιος με αυτόν σε άτομα χωρίς λεμφαδένες28. Επομένως, το ελάχιστο μέγεθος που απαιτεί τακτική παρακολούθηση με CT είναι 5 mm, όπως συνιστάται από τη Βρετανική Πνευμονολογική Εταιρεία (BTS), και 6 mm, όπως συνιστάται από την Εταιρεία Fleischner29. Ωστόσο, οζίδια μεγαλύτερα από 6 mm και χωρίς εμφανή καλοήθη χαρακτηριστικά, που ονομάζονται απροσδιόριστοι πνευμονικοί οζίδια (IPN), παραμένουν μια σημαντική πρόκληση στην αξιολόγηση και τη διαχείριση στην κλινική πράξη30,31. Στη συνέχεια εξετάσαμε εάν το μέγεθος των οζιδίων επηρέασε τις μεταβολομικές υπογραφές χρησιμοποιώντας συγκεντρωτικά δείγματα από τις ομάδες ανακάλυψης και εσωτερικής επικύρωσης. Εστιάζοντας σε 27 επικυρωμένους βιοδείκτες, συγκρίναμε πρώτα τα προφίλ PCA των μεταβολωμάτων HC και BN κάτω των 6 mm. Διαπιστώσαμε ότι τα περισσότερα σημεία δεδομένων για το HC και το BN αλληλεπικαλύπτονταν, αποδεικνύοντας ότι τα επίπεδα των μεταβολιτών στον ορό ήταν παρόμοια και στις δύο ομάδες (Εικ. 3α). Οι χάρτες χαρακτηριστικών σε διαφορετικά εύρη μεγέθους παρέμειναν διατηρημένοι στο BN και το LA (Εικ. 3β, γ), ενώ παρατηρήθηκε διαχωρισμός μεταξύ κακοήθων και καλοήθων οζιδίων στην περιοχή των 6-20 mm (Εικ. 3δ). Αυτή η ομάδα είχε AUC 0,927, ειδικότητα 0,868 και ευαισθησία 0,820 για την πρόβλεψη της κακοήθειας οζιδίων μεγέθους 6 έως 20 mm (Εικ. 3ε, στ). Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι ο ταξινομητής μπορεί να καταγράψει τις μεταβολικές αλλαγές που προκαλούνται από πρώιμο κακοήθη μετασχηματισμό, ανεξάρτητα από το μέγεθος του οζιδίου.
ad Σύγκριση των προφίλ PCA μεταξύ συγκεκριμένων ομάδων με βάση έναν μεταβολικό ταξινομητή 27 μεταβολιτών. CC και BN < 6 mm. b BN < 6 mm έναντι BN 6–20 mm. σε LA 6–20 mm έναντι LA 20–30 mm. g BN 6–20 mm και LA 6–20 mm. GC, n = 174; BN < 6 mm, n = 153; BN 6–20 mm, n = 91; LA 6–20 mm, n = 89; LA 20–30 mm, n = 77. e Καμπύλη χαρακτηριστικών λειτουργίας δέκτη (ROC) που δείχνει την απόδοση του διακριτικού μοντέλου για οζίδια 6–20 mm. f Οι τιμές πιθανότητας υπολογίστηκαν με βάση το μοντέλο λογιστικής παλινδρόμησης για οζίδια διαμέτρου 6–20 mm. Η γκρι διακεκομμένη γραμμή αντιπροσωπεύει τη βέλτιστη τιμή αποκοπής (0,455). Οι παραπάνω αριθμοί αντιπροσωπεύουν το ποσοστό των περιπτώσεων που προβλέπονται για το Λος Άντζελες. Χρησιμοποιήστε ένα αμφίπλευρο τεστ Student's t. PCA, ανάλυση κύριων συνιστωσών. Εμβαδόν AUC κάτω από την καμπύλη. Τα δεδομένα πηγής παρέχονται με τη μορφή αρχείων δεδομένων πηγής.
Τέσσερα δείγματα (ηλικίας 44-61 ετών) με παρόμοια μεγέθη πνευμονικών όζων (7-9 mm) επιλέχθηκαν περαιτέρω για να απεικονιστεί η απόδοση του προτεινόμενου μοντέλου πρόβλεψης κακοήθειας (Εικ. 4α, β). Κατά την αρχική διαλογή, η Περίπτωση 1 παρουσιάστηκε ως συμπαγής όζος με ασβεστοποίηση, ένα χαρακτηριστικό που σχετίζεται με την καλοήθεια, ενώ η Περίπτωση 2 παρουσιάστηκε ως απροσδιόριστος μερικώς συμπαγής όζος χωρίς εμφανή καλοήθη χαρακτηριστικά. Τρεις γύροι αξονικών τομογραφιών παρακολούθησης έδειξαν ότι αυτές οι περιπτώσεις παρέμειναν σταθερές για μια περίοδο 4 ετών και επομένως θεωρήθηκαν καλοήθεις όζοι (Εικ. 4α). Σε σύγκριση με την κλινική αξιολόγηση διαδοχικών αξονικών τομογραφιών, η ανάλυση μεταβολιτών ορού με μία μόνο βολή με το τρέχον μοντέλο ταξινόμησης αναγνώρισε γρήγορα και σωστά αυτούς τους καλοήθεις όζους με βάση πιθανολογικούς περιορισμούς (Πίνακας 1). Το Σχήμα 4β στην περίπτωση 3 δείχνει έναν όζο με σημάδια υπεζωκοτικής συστολής, η οποία συχνότερα σχετίζεται με κακοήθεια32. Η Περίπτωση 4 παρουσιάστηκε ως απροσδιόριστος μερικώς συμπαγής όζος χωρίς ενδείξεις καλοήθους αιτίας. Όλες αυτές οι περιπτώσεις προβλέφθηκαν ως κακοήθεις σύμφωνα με το μοντέλο ταξινόμησης (Πίνακας 1). Η αξιολόγηση του αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα αποδείχθηκε με ιστοπαθολογική εξέταση μετά από χειρουργική επέμβαση εκτομής πνεύμονα (Εικ. 4β). Για το σύνολο εξωτερικής επικύρωσης, ο μεταβολικός ταξινομητής προέβλεψε με ακρίβεια δύο περιπτώσεις απροσδιόριστων πνευμονικών οζιδίων μεγαλύτερων από 6 mm (Συμπληρωματικό Σχήμα 10).
Αξονικές εικόνες του αξονικού παραθύρου των πνευμόνων δύο περιπτώσεων καλοήθων οζιδίων. Στην περίπτωση 1, η αξονική τομογραφία μετά από 4 χρόνια έδειξε ένα σταθερό συμπαγές οζίδιο διαμέτρου 7 mm με ασβεστοποίηση στον δεξιό κάτω λοβό. Στην περίπτωση 2, η αξονική τομογραφία μετά από 5 χρόνια αποκάλυψε ένα σταθερό, μερικώς συμπαγές οζίδιο με διάμετρο 7 mm στον δεξιό άνω λοβό. β Εικόνες αξονικής τομογραφίας των πνευμόνων με αξονικό παραθύρωμα και αντίστοιχες παθολογοανατομικές μελέτες δύο περιπτώσεων αδενοκαρκινώματος σταδίου Ι πριν από την εκτομή του πνεύμονα. Η περίπτωση 3 αποκάλυψε ένα οζίδιο με διάμετρο 8 mm στον δεξιό άνω λοβό με υπεζωκοτική συστολή. Η περίπτωση 4 αποκάλυψε ένα μερικώς συμπαγές οζίδιο θολής υάλου διαμέτρου 9 mm στον αριστερό άνω λοβό. Χρώση αιματοξυλίνης και ηωσίνης (H&E) του αφαιρεμένου πνευμονικού ιστού (κλίμακα bar = 50 μm) που καταδεικνύει το πρότυπο ανάπτυξης κυψελίδων του αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα. Τα βέλη υποδεικνύουν οζίδια που ανιχνεύθηκαν σε εικόνες αξονικής τομογραφίας. Οι εικόνες H&E είναι αντιπροσωπευτικές εικόνες πολλαπλών (>3) μικροσκοπικών πεδίων που εξετάστηκαν από τον παθολόγο.
Συνολικά, τα αποτελέσματά μας καταδεικνύουν την πιθανή αξία των βιοδεικτών μεταβολιτών ορού στη διαφορική διάγνωση πνευμονικών οζιδίων, κάτι που μπορεί να δημιουργήσει προκλήσεις κατά την αξιολόγηση του ελέγχου με αξονική τομογραφία.
Με βάση ένα επικυρωμένο πάνελ διαφορικών μεταβολιτών, επιδιώξαμε να εντοπίσουμε βιολογικές συσχετίσεις των κύριων μεταβολικών αλλαγών. Η ανάλυση εμπλουτισμού των οδών KEGG από την MetaboAnalyst εντόπισε 6 κοινές σημαντικά τροποποιημένες οδούς μεταξύ των δύο δεδομένων ομάδων (LA έναντι HC και LA έναντι BN, προσαρμοσμένο p ≤ 0,001, επίδραση > 0,01). Αυτές οι αλλαγές χαρακτηρίστηκαν από διαταραχές στον μεταβολισμό του πυροσταφυλικού οξέος, στον μεταβολισμό της τρυπτοφάνης, στον μεταβολισμό της νιασίνης και της νικοτιναμίδης, στη γλυκόλυση, στον κύκλο TCA και στον μεταβολισμό της πουρίνης (Εικ. 5α). Στη συνέχεια, πραγματοποιήσαμε περαιτέρω στοχευμένη μεταβολομική για να επαληθεύσουμε τις κύριες αλλαγές χρησιμοποιώντας απόλυτη ποσοτικοποίηση. Προσδιορισμός κοινών μεταβολιτών σε συχνά τροποποιημένες οδούς με τριπλή τετραπολική φασματομετρία μάζας (QQQ) χρησιμοποιώντας αυθεντικά πρότυπα μεταβολιτών. Τα δημογραφικά χαρακτηριστικά του δείγματος-στόχου της μεταβολομικής μελέτης περιλαμβάνονται στον Συμπληρωματικό Πίνακα 4. Σύμφωνα με τα συνολικά μεταβολικά μας αποτελέσματα, η ποσοτική ανάλυση επιβεβαίωσε ότι η υποξανθίνη και η ξανθίνη, το πυροσταφυλικό και το γαλακτικό οξύ αυξήθηκαν στο LA σε σύγκριση με το BN και το HC (Εικόνα 5b, c, p <0,05). Ωστόσο, δεν βρέθηκαν σημαντικές διαφορές σε αυτούς τους μεταβολίτες μεταξύ του BN και του HC.
Ανάλυση εμπλουτισμού της οδού KEGG σημαντικά διαφορετικών μεταβολιτών στην ομάδα LA σε σύγκριση με τις ομάδες BN και HC. Χρησιμοποιήθηκε αμφίπλευρο Globaltest και οι τιμές p προσαρμόστηκαν χρησιμοποιώντας τη μέθοδο Holm-Bonferroni (προσαρμοσμένο p ≤ 0,001 και μέγεθος αποτελέσματος > 0,01). b–d Διαγράμματα βιολιού που δείχνουν τα επίπεδα υποξανθίνης, ξανθίνης, γαλακτικού, πυροσταφυλικού και τρυπτοφάνης σε HC, BN και LA ορού που προσδιορίστηκαν με LC-MS/MS (n = 70 ανά ομάδα). Οι λευκές και μαύρες διακεκομμένες γραμμές υποδεικνύουν τη διάμεση τιμή και το τεταρτημόριο, αντίστοιχα. e Διάγραμμα βιολιού που δείχνει την κανονικοποιημένη έκφραση mRNA Log2TPM (μεταγραφές ανά εκατομμύριο) των SLC7A5 και QPRT σε αδενοκαρκίνωμα πνεύμονα (n = 513) σε σύγκριση με τον φυσιολογικό πνευμονικό ιστό (n = 59) στο σύνολο δεδομένων LUAD-TCGA. Το λευκό πλαίσιο αντιπροσωπεύει το διατεταρτημοριακό εύρος, η οριζόντια μαύρη γραμμή στο κέντρο αντιπροσωπεύει τη διάμεση τιμή και η κάθετη μαύρη γραμμή που εκτείνεται από το πλαίσιο αντιπροσωπεύει το διάστημα εμπιστοσύνης 95% (CI). f Διάγραμμα συσχέτισης Pearson της έκφρασης SLC7A5 και GAPDH σε αδενοκαρκίνωμα πνεύμονα (n = 513) και φυσιολογικό πνευμονικό ιστό (n = 59) στο σύνολο δεδομένων TCGA. Η γκρίζα περιοχή αντιπροσωπεύει το 95% CI. r, συντελεστής συσχέτισης Pearson. g Ομαλοποιημένα κυτταρικά επίπεδα τρυπτοφάνης σε κύτταρα A549 που έχουν μεταμοσχευθεί με μη ειδικό έλεγχο shRNA (NC) και shSLC7A5 (Sh1, Sh2) που προσδιορίστηκαν με LC-MS/MS. Παρουσιάζεται στατιστική ανάλυση πέντε βιολογικά ανεξάρτητων δειγμάτων σε κάθε ομάδα. h Κυτταρικά επίπεδα NADt (ολικό NAD, συμπεριλαμβανομένων των NAD+ και NADH) σε κύτταρα A549 (NC) και κύτταρα A549 που έχουν καταρρεύσει από SLC7A5 (Sh1, Sh2). Παρουσιάζεται στατιστική ανάλυση τριών βιολογικά ανεξάρτητων δειγμάτων σε κάθε ομάδα. Η γλυκολυτική δράση των κυττάρων A549 πριν και μετά την καταστολή του SLC7A5 μετρήθηκε με τον ρυθμό εξωκυτταρικής οξίνισης (ECAR) (n = 4 βιολογικά ανεξάρτητα δείγματα ανά ομάδα). 2-DG,2-δεοξυ-D-γλυκόζη. Στο (b–h) χρησιμοποιήθηκε το αμφίπλευρο τεστ t του Student. Στο (g–i), οι γραμμές σφάλματος αντιπροσωπεύουν τον μέσο όρο ± τυπική απόκλιση, κάθε πείραμα πραγματοποιήθηκε τρεις φορές ανεξάρτητα και τα αποτελέσματα ήταν παρόμοια. Τα δεδομένα πηγής παρέχονται με τη μορφή αρχείων δεδομένων πηγής.
Λαμβάνοντας υπόψη τη σημαντική επίδραση του μεταβολισμού της τρυπτοφάνης στην ομάδα LA, αξιολογήσαμε επίσης τα επίπεδα τρυπτοφάνης στον ορό στις ομάδες HC, BN και LA χρησιμοποιώντας QQQ. Διαπιστώσαμε ότι η τρυπτοφάνη στον ορό ήταν μειωμένη στο LA σε σύγκριση με το HC ή το BN (p < 0,001, Σχήμα 5d), γεγονός που συνάδει με προηγούμενα ευρήματα ότι τα επίπεδα τρυπτοφάνης στην κυκλοφορία του αίματος είναι χαμηλότερα σε ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα από ό,τι σε υγιείς μάρτυρες από την ομάδα ελέγχου33,34,35. Μια άλλη μελέτη που χρησιμοποίησε τον ιχνηθέτη PET/CT 11C-μεθυλ-L-τρυπτοφάνη διαπίστωσε ότι ο χρόνος κατακράτησης σήματος τρυπτοφάνης στον ιστό καρκίνου του πνεύμονα ήταν σημαντικά αυξημένος σε σύγκριση με τις καλοήθεις αλλοιώσεις ή τον φυσιολογικό ιστό36. Υποθέτουμε ότι η μείωση της τρυπτοφάνης στον ορό του LA μπορεί να αντανακλά την ενεργό πρόσληψη τρυπτοφάνης από τα καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα.
Είναι επίσης γνωστό ότι το τελικό προϊόν της οδού κυνουρενίνης του καταβολισμού της τρυπτοφάνης είναι το NAD+37,38, το οποίο είναι ένα σημαντικό υπόστρωμα για την αντίδραση της γλυκεραλδεΰδης-3-φωσφορικής με το 1,3-διφωσφογλυκερικό στη γλυκόλυση39. Ενώ προηγούμενες μελέτες έχουν επικεντρωθεί στον ρόλο του καταβολισμού της τρυπτοφάνης στην ανοσολογική ρύθμιση, εμείς επιδιώξαμε να διευκρινίσουμε την αλληλεπίδραση μεταξύ της δυσλειτουργίας της τρυπτοφάνης και των γλυκολυτικών οδών που παρατηρήθηκε στην παρούσα μελέτη. Το μέλος 5 της οικογένειας μεταφορέων διαλυμένης ουσίας 7 (SLC7A5) είναι γνωστό ότι είναι ένας μεταφορέας τρυπτοφάνης43,44,45. Η φωσφοριβοσυλοτρανσφεράση του κινολινικού οξέος (QPRT) είναι ένα ένζυμο που βρίσκεται κατάντη της οδού κυνουρενίνης που μετατρέπει το κινολινικό οξύ σε NAMN46. Η επιθεώρηση του συνόλου δεδομένων LUAD TCGA αποκάλυψε ότι τόσο το SLC7A5 όσο και το QPRT ήταν σημαντικά αυξημένα στον καρκινικό ιστό σε σύγκριση με τον φυσιολογικό ιστό (Εικ. 5ε). Αυτή η αύξηση παρατηρήθηκε στα στάδια Ι και II καθώς και στα στάδια III και IV του αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα (Συμπληρωματικό Σχήμα 11), υποδεικνύοντας πρώιμες διαταραχές στον μεταβολισμό της τρυπτοφάνης που σχετίζονται με την καρκινογένεση.
Επιπλέον, το σύνολο δεδομένων LUAD-TCGA έδειξε θετική συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης mRNA του SLC7A5 και του GAPDH σε δείγματα ασθενών με καρκίνο (r = 0,45, p = 1,55E-26, Σχήμα 5f). Αντίθετα, δεν βρέθηκε σημαντική συσχέτιση μεταξύ τέτοιων γονιδιακών υπογραφών σε φυσιολογικό πνευμονικό ιστό (r = 0,25, p = 0,06, Σχήμα 5f). Η καταστολή του SLC7A5 (Συμπληρωματικό Σχήμα 12) σε κύτταρα A549 μείωσε σημαντικά τα κυτταρικά επίπεδα τρυπτοφάνης και NAD(H)2 (Σχήμα 5g,h), με αποτέλεσμα εξασθενημένη γλυκολυτική δράση όπως μετράται με τον ρυθμό εξωκυτταρικής οξίνισης (ECAR) (Σχήμα 1). 5i). Έτσι, με βάση τις μεταβολικές αλλαγές στον ορό και την ανίχνευση in vitro, υποθέτουμε ότι ο μεταβολισμός της τρυπτοφάνης μπορεί να παράγει NAD+ μέσω της οδού κυνουρενίνης και να παίζει σημαντικό ρόλο στην προαγωγή της γλυκόλυσης στον καρκίνο του πνεύμονα.
Μελέτες έχουν δείξει ότι ένας μεγάλος αριθμός απροσδιόριστων πνευμονικών οζιδίων που ανιχνεύονται με LDCT μπορεί να οδηγήσει στην ανάγκη για πρόσθετες εξετάσεις όπως PET-CT, βιοψία πνεύμονα και υπερβολική θεραπεία λόγω ψευδώς θετικής διάγνωσης κακοήθειας.31 Όπως φαίνεται στο Σχήμα 6, η μελέτη μας εντόπισε μια ομάδα μεταβολιτών ορού με πιθανή διαγνωστική αξία που μπορεί να βελτιώσει την διαστρωμάτωση κινδύνου και την επακόλουθη διαχείριση των πνευμονικών οζιδίων που ανιχνεύονται με CT.
Οι πνευμονικοί όζοι αξιολογούνται με χρήση αξονικής τομογραφίας χαμηλής δόσης (LDCT) με απεικονιστικά χαρακτηριστικά που υποδηλώνουν καλοήθεις ή κακοήθεις αιτίες. Η αβέβαιη έκβαση των όζων μπορεί να οδηγήσει σε συχνές επισκέψεις παρακολούθησης, περιττές παρεμβάσεις και υπερβολική θεραπεία. Η συμπερίληψη ταξινομητών μεταβολισμού ορού με διαγνωστική αξία μπορεί να βελτιώσει την αξιολόγηση κινδύνου και την επακόλουθη διαχείριση των πνευμονικών όζων. Τομογραφία εκπομπής ποζιτρονίων PET.
Δεδομένα από τη μελέτη NLST των ΗΠΑ και την ευρωπαϊκή μελέτη NELSON υποδηλώνουν ότι ο έλεγχος ομάδων υψηλού κινδύνου με αξονική τομογραφία χαμηλής δόσης (LDCT) μπορεί να μειώσει τη θνησιμότητα από καρκίνο του πνεύμονα1,3. Ωστόσο, η αξιολόγηση του κινδύνου και η επακόλουθη κλινική διαχείριση μεγάλου αριθμού τυχαίων πνευμονικών οζιδίων που ανιχνεύονται με LDCT παραμένουν οι πιο απαιτητικές. Ο κύριος στόχος είναι η βελτιστοποίηση της σωστής ταξινόμησης των υφιστάμενων πρωτοκόλλων που βασίζονται σε LDCT, ενσωματώνοντας αξιόπιστους βιοδείκτες.
Ορισμένοι μοριακοί βιοδείκτες, όπως οι μεταβολίτες του αίματος, έχουν εντοπιστεί συγκρίνοντας τον καρκίνο του πνεύμονα με υγιείς μάρτυρες15,17. Στην παρούσα μελέτη, εστιάσαμε στην εφαρμογή της μεταβολομικής ανάλυσης ορού για τη διάκριση μεταξύ καλοήθων και κακοήθων πνευμονικών οζιδίων που ανιχνεύθηκαν τυχαία με LDCT. Συγκρίναμε το συνολικό μεταβολόγραμμα ορού δειγμάτων υγιούς μαρτύρων (HC), καλοήθων πνευμονικών οζιδίων (BN) και πνευμονικού αδενοκαρκινώματος σταδίου Ι (LA) χρησιμοποιώντας ανάλυση UPLC-HRMS. Διαπιστώσαμε ότι τα HC και BN είχαν παρόμοια μεταβολικά προφίλ, ενώ τα LA εμφάνισαν σημαντικές αλλαγές σε σύγκριση με τα HC και BN. Εντοπίσαμε δύο σύνολα μεταβολιτών ορού που διαφοροποιούν τα LA από τα HC και BN.
Το τρέχον σχήμα ταυτοποίησης καλοήθων και κακοήθων οζιδίων που βασίζεται στην LDCT βασίζεται κυρίως στο μέγεθος, την πυκνότητα, τη μορφολογία και τον ρυθμό ανάπτυξης των οζιδίων με την πάροδο του χρόνου30. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι το μέγεθος των οζιδίων σχετίζεται στενά με την πιθανότητα καρκίνου του πνεύμονα. Ακόμη και σε ασθενείς υψηλού κινδύνου, ο κίνδυνος κακοήθειας σε λεμφαδένες <6 mm είναι <1%. Ο κίνδυνος κακοήθειας για οζίδια διαστάσεων 6 έως 20 mm κυμαίνεται από 8% έως 64%30. Ως εκ τούτου, η Εταιρεία Fleischner συνιστά μια διάμετρο αποκοπής 6 mm για την τακτική παρακολούθηση με αξονική τομογραφία.29 Ωστόσο, η αξιολόγηση κινδύνου και η διαχείριση απροσδιόριστων πνευμονικών οζιδίων (IPN) μεγαλύτερων από 6 mm δεν έχουν πραγματοποιηθεί επαρκώς31. Η τρέχουσα διαχείριση των συγγενών καρδιοπαθειών βασίζεται συνήθως στην προσεκτική αναμονή με συχνή παρακολούθηση με αξονική τομογραφία.
Με βάση το επικυρωμένο μεταβολόγραμμα, καταδείξαμε για πρώτη φορά την επικάλυψη των μεταβολομικών υπογραφών μεταξύ υγιών ατόμων και καλοήθων οζιδίων <6 mm. Η βιολογική ομοιότητα είναι σύμφωνη με προηγούμενα ευρήματα αξονικής τομογραφίας, ότι ο κίνδυνος κακοήθειας για οζίδια <6 mm είναι τόσο χαμηλός όσο και για άτομα χωρίς λεμφαδένες.30 Θα πρέπει να σημειωθεί ότι τα αποτελέσματά μας δείχνουν επίσης ότι οι καλοήθεις οζίδια <6 mm και ≥6 mm έχουν υψηλή ομοιότητα στα μεταβολομικά προφίλ, υποδηλώνοντας ότι ο λειτουργικός ορισμός της καλοήθους αιτιολογίας είναι συνεπής ανεξάρτητα από το μέγεθος των οζιδίων. Έτσι, τα σύγχρονα διαγνωστικά πάνελ μεταβολιτών ορού μπορούν να παρέχουν μία μόνο δοκιμασία ως δοκιμή αποκλεισμού όταν οι οζίδια ανιχνεύονται αρχικά στην αξονική τομογραφία και ενδεχομένως να μειώσουν τη διαδοχική παρακολούθηση. Ταυτόχρονα, το ίδιο πάνελ μεταβολικών βιοδεικτών διέκρινε κακοήθεις οζίδια μεγέθους ≥6 mm από καλοήθεις οζίδια και παρείχε ακριβείς προβλέψεις για IPN παρόμοιου μεγέθους και διφορούμενα μορφολογικά χαρακτηριστικά σε εικόνες αξονικής τομογραφίας. Αυτός ο ταξινομητής μεταβολισμού ορού είχε καλή απόδοση στην πρόβλεψη της κακοήθειας οζιδίων ≥6 mm με AUC 0,927. Συνολικά, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι οι μοναδικές μεταβολικές υπογραφές στον ορό μπορεί να αντανακλούν συγκεκριμένα πρώιμες μεταβολικές αλλαγές που προκαλούνται από τον όγκο και να έχουν πιθανή αξία ως προγνωστικοί παράγοντες κινδύνου, ανεξάρτητα από το μέγεθος των οζιδίων.
Αξιοσημείωτα, το αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα (LUAD) και το πλακώδες καρκίνωμα (LUSC) είναι οι κύριοι τύποι μη μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα (NSCLC). Δεδομένου ότι το LUSC σχετίζεται έντονα με τη χρήση καπνού47 και το LUAD είναι η πιο συχνή ιστολογία τυχαίων πνευμονικών οζιδίων που ανιχνεύονται σε αξονική τομογραφία48, το μοντέλο ταξινομητή μας δημιουργήθηκε ειδικά για δείγματα αδενοκαρκινώματος σταδίου Ι. Ο Wang και οι συνεργάτες του επικεντρώθηκαν επίσης στο LUAD και εντόπισαν εννέα λιπιδικές υπογραφές χρησιμοποιώντας λιπιδομικά για να διακρίνουν τον καρκίνο του πνεύμονα σε πρώιμο στάδιο από υγιή άτομα17. Δοκιμάσαμε το τρέχον μοντέλο ταξινομητή σε 16 περιπτώσεις LUSC σταδίου Ι και 74 καλοήθεις οζίδια και παρατηρήσαμε χαμηλή ακρίβεια πρόβλεψης LUSC (AUC 0,776), υποδηλώνοντας ότι το LUAD και το LUSC μπορεί να έχουν τις δικές τους μεταβολομικές υπογραφές. Πράγματι, έχει αποδειχθεί ότι το LUAD και το LUSC διαφέρουν ως προς την αιτιολογία, τη βιολογική προέλευση και τις γενετικές ανωμαλίες49. Επομένως, άλλοι τύποι ιστολογίας θα πρέπει να συμπεριληφθούν στα μοντέλα εκπαίδευσης για την ανίχνευση καρκίνου του πνεύμονα με βάση τον πληθυσμό σε προγράμματα διαλογής.
Εδώ, εντοπίσαμε τις έξι συχνότερα μεταβαλλόμενες οδούς στο αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα σε σύγκριση με υγιείς μάρτυρες και καλοήθεις όζους. Η ξανθίνη και η υποξανθίνη είναι συνηθισμένοι μεταβολίτες της μεταβολικής οδού της πουρίνης. Σύμφωνα με τα αποτελέσματά μας, τα ενδιάμεσα που σχετίζονται με τον μεταβολισμό της πουρίνης αυξήθηκαν σημαντικά στον ορό ή τους ιστούς ασθενών με αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα σε σύγκριση με υγιείς μάρτυρες ή ασθενείς στο προεπεμβατικό στάδιο15,50. Τα αυξημένα επίπεδα ξανθίνης και υποξανθίνης στον ορό μπορεί να αντανακλούν τον αναβολισμό που απαιτείται από τα ταχέως πολλαπλασιαζόμενα καρκινικά κύτταρα. Η δυσλειτουργία του μεταβολισμού της γλυκόζης είναι ένα γνωστό χαρακτηριστικό του μεταβολισμού του καρκίνου51. Εδώ, παρατηρήσαμε μια σημαντική αύξηση στο πυροσταφυλικό και το γαλακτικό στην ομάδα LA σε σύγκριση με την ομάδα HC και BN, η οποία είναι σύμφωνη με προηγούμενες αναφορές ανωμαλιών της γλυκολυτικής οδού στα προφίλ μεταβολισμού ορού ασθενών με μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) και υγιών μαρτύρων. Τα αποτελέσματα είναι συνεπή52,53.
Σημαντικό είναι ότι παρατηρήσαμε μια αντίστροφη συσχέτιση μεταξύ του μεταβολισμού του πυροσταφυλικού οξέος και της τρυπτοφάνης στον ορό των αδενοκαρκινωμάτων του πνεύμονα. Τα επίπεδα τρυπτοφάνης στον ορό ήταν μειωμένα στην ομάδα LA σε σύγκριση με την ομάδα HC ή BN. Είναι ενδιαφέρον ότι μια προηγούμενη μελέτη μεγάλης κλίμακας που χρησιμοποίησε μια προοπτική ομάδα διαπίστωσε ότι τα χαμηλά επίπεδα κυκλοφορούσας τρυπτοφάνης συσχετίστηκαν με αυξημένο κίνδυνο καρκίνου του πνεύμονα 54. Η τρυπτοφάνη είναι ένα απαραίτητο αμινοξύ που λαμβάνουμε εξ ολοκλήρου από τις τροφές. Καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι η μείωση της τρυπτοφάνης στον ορό στο αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα μπορεί να αντανακλά την ταχεία μείωση αυτού του μεταβολίτη. Είναι γνωστό ότι το τελικό προϊόν του καταβολισμού της τρυπτοφάνης μέσω της οδού κυνουρενίνης είναι η πηγή της de novo σύνθεσης NAD+. Επειδή το NAD+ παράγεται κυρίως μέσω της οδού διάσωσης, η σημασία του NAD+ στον μεταβολισμό της τρυπτοφάνης στην υγεία και την ασθένεια παραμένει άγνωστη46. Η ανάλυσή μας στη βάση δεδομένων TCGA έδειξε ότι η έκφραση του μεταφορέα διαλυμένης ουσίας τρυπτοφάνης 7A5 (SLC7A5) ήταν σημαντικά αυξημένη στο αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα σε σύγκριση με τους φυσιολογικούς μάρτυρες και συσχετίστηκε θετικά με την έκφραση του γλυκολυτικού ενζύμου GAPDH. Προηγούμενες μελέτες έχουν επικεντρωθεί κυρίως στον ρόλο του καταβολισμού της τρυπτοφάνης στην καταστολή της αντικαρκινικής ανοσολογικής απόκρισης40,41,42. Εδώ καταδεικνύουμε ότι η αναστολή της πρόσληψης τρυπτοφάνης μέσω της καταστολής του SLC7A5 σε κύτταρα καρκίνου του πνεύμονα έχει ως αποτέλεσμα μια επακόλουθη μείωση των κυτταρικών επιπέδων NAD και μια ταυτόχρονη εξασθένηση της γλυκολυτικής δράσης. Συνοψίζοντας, η μελέτη μας παρέχει μια βιολογική βάση για αλλαγές στον μεταβολισμό του ορού που σχετίζονται με τον κακοήθη μετασχηματισμό του αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα.
Οι μεταλλάξεις του EGFR είναι οι πιο συχνές μεταλλάξεις-οδηγοί σε ασθενείς με NSCLC. Στη μελέτη μας, διαπιστώσαμε ότι ασθενείς με μετάλλαξη EGFR (n = 41) είχαν συνολικά μεταβολομικά προφίλ παρόμοια με ασθενείς με EGFR άγριου τύπου (n = 31), αν και διαπιστώσαμε μειωμένα επίπεδα ορού σε ορισμένους ασθενείς με μεταλλαγμένο EGFR σε ασθενείς με ακυλοκαρνιτίνη. Η καθιερωμένη λειτουργία των ακυλοκαρνιτινών είναι η μεταφορά ακυλομάδων από το κυτταρόπλασμα στο μιτοχονδριακό πλέγμα, οδηγώντας στην οξείδωση των λιπαρών οξέων για την παραγωγή ενέργειας 55. Σύμφωνα με τα ευρήματά μας, μια πρόσφατη μελέτη εντόπισε επίσης παρόμοια προφίλ μεταβολισμού μεταξύ του μεταλλαγμένου EGFR και των όγκων άγριου τύπου EGFR, αναλύοντας το συνολικό μεταβολισμό 102 δειγμάτων ιστού αδενοκαρκινώματος πνεύμονα 50. Είναι ενδιαφέρον ότι η περιεκτικότητα σε ακυλοκαρνιτίνη βρέθηκε επίσης στην ομάδα με μεταλλαγμένο EGFR. Επομένως, το κατά πόσον οι αλλαγές στα επίπεδα ακυλοκαρνιτίνης αντανακλούν μεταβολικές αλλαγές που προκαλούνται από τον EGFR και τις υποκείμενες μοριακές οδούς μπορεί να χρήζει περαιτέρω μελέτης.
Συμπερασματικά, η μελέτη μας καθιερώνει έναν μεταβολικό ταξινομητή ορού για τη διαφορική διάγνωση των πνευμονικών οζιδίων και προτείνει μια ροή εργασίας που μπορεί να βελτιστοποιήσει την αξιολόγηση κινδύνου και να διευκολύνει την κλινική διαχείριση με βάση τον έλεγχο με αξονική τομογραφία.
Αυτή η μελέτη εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας του Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου Καρκίνου Sun Yat-sen, του Πρώτου Συνεργαζόμενου Νοσοκομείου του Πανεπιστημίου Sun Yat-sen και της Επιτροπής Δεοντολογίας του Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου Καρκίνου Zhengzhou. Στις ομάδες ανακάλυψης και εσωτερικής επικύρωσης, συλλέχθηκαν 174 οροί από υγιή άτομα και 244 οροί από καλοήθη οζίδια από άτομα που υποβάλλονταν σε ετήσιες ιατρικές εξετάσεις στο Τμήμα Ελέγχου και Πρόληψης του Καρκίνου, στο Κέντρο Καρκίνου του Πανεπιστημίου Sun Yat-sen, και 166 καλοήθη οζίδια ορού. Τα αδενοκαρκινώματα πνεύμονα σταδίου Ι συλλέχθηκαν από το Πανεπιστημιακό Κέντρο Καρκίνου Sun Yat-sen. Στην ομάδα εξωτερικής επικύρωσης, υπήρχαν 48 περιπτώσεις καλοήθων οζιδίων, 39 περιπτώσεις αδενοκαρκινώματος πνεύμονα σταδίου Ι από το Πρώτο Συνεργαζόμενο Νοσοκομείο του Πανεπιστημίου Sun Yat-sen και 24 περιπτώσεις αδενοκαρκινώματος πνεύμονα σταδίου Ι από το Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο Καρκίνου Zhengzhou. Το Πανεπιστημιακό Κέντρο Καρκίνου Sun Yat-sen συνέλεξε επίσης 16 περιπτώσεις πλακώδους καρκίνου του πνεύμονα σταδίου Ι για να ελέγξει τη διαγνωστική ικανότητα του καθιερωμένου μεταβολικού ταξινομητή (τα χαρακτηριστικά του ασθενούς φαίνονται στον Συμπληρωματικό Πίνακα 5). Δείγματα από την ομάδα ανακάλυψης και την ομάδα εσωτερικής επικύρωσης συλλέχθηκαν μεταξύ Ιανουαρίου 2018 και Μαΐου 2020. Δείγματα για την ομάδα εξωτερικής επικύρωσης συλλέχθηκαν μεταξύ Αυγούστου 2021 και Οκτωβρίου 2022. Για την ελαχιστοποίηση της προκατάληψης λόγω φύλου, σε κάθε ομάδα αντιστοιχίστηκε περίπου ίσος αριθμός ανδρών και γυναικών. Ομάδα Ανακάλυψης και Ομάδα Εσωτερικής Αξιολόγησης. Το φύλο του συμμετέχοντα προσδιορίστηκε με βάση την αυτοαναφορά. Ελήφθη ενημερωμένη συγκατάθεση από όλους τους συμμετέχοντες και δεν δόθηκε αποζημίωση. Τα άτομα με καλοήθεις όζους ήταν εκείνα με σταθερή βαθμολογία αξονικής τομογραφίας στα 2 έως 5 έτη κατά τη στιγμή της ανάλυσης, εκτός από 1 περίπτωση από το δείγμα εξωτερικής επικύρωσης, η οποία συλλέχθηκε προεγχειρητικά και διαγνώστηκε με ιστοπαθολογία. Με εξαίρεση τη χρόνια βρογχίτιδα. Οι περιπτώσεις αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα συλλέχθηκαν πριν από την εκτομή του πνεύμονα και επιβεβαιώθηκαν με παθολογική διάγνωση. Δείγματα αίματος νηστείας συλλέχθηκαν σε σωλήνες διαχωρισμού ορού χωρίς αντιπηκτικά. Τα δείγματα αίματος πήχθηκαν για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου και στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκαν στα 2851 × g για 10 λεπτά στους 4°C για τη συλλογή του υπερκείμενου ορού. Τα δείγματα ορού καταψύχθηκαν στους -80°C μέχρι την εξαγωγή του μεταβολίτη. Το Τμήμα Πρόληψης του Καρκίνου και Ιατρικής Εξέτασης του Κέντρου Καρκίνου του Πανεπιστημίου Sun Yat-sen συνέλεξε ένα σύνολο ορού από 100 υγιείς δότες, συμπεριλαμβανομένου ίσου αριθμού ανδρών και γυναικών ηλικίας 40 έως 55 ετών. Ίσοι όγκοι από κάθε δείγμα δότη αναμίχθηκαν, το προκύπτον σύνολο διαιρέθηκε και αποθηκεύτηκε στους -80°C. Το μείγμα ορού χρησιμοποιήθηκε ως υλικό αναφοράς για τον ποιοτικό έλεγχο και την τυποποίηση δεδομένων.
Ο ορός αναφοράς και τα δείγματα δοκιμής αποψύχθηκαν και οι μεταβολίτες εκχυλίστηκαν χρησιμοποιώντας μια συνδυασμένη μέθοδο εκχύλισης (MTBE/μεθανόλη/νερό) 56. Εν συντομία, 50 μl ορού αναμίχθηκαν με 225 μl παγωμένης μεθανόλης και 750 μl παγωμένου μεθυλο-τερτ-βουτυλαιθέρα (MTBE). Ανακατέψτε το μείγμα και επωάστε σε πάγο για 1 ώρα. Στη συνέχεια, τα δείγματα αναμίχθηκαν και αναμίχθηκαν σε στροβιλισμό με 188 μl νερού βαθμού MS που περιείχε εσωτερικά πρότυπα (13C-λακτικό, 13C3-πυροσταφυλικό, 13C-μεθειονίνη και 13C6-ισολευκίνη, που αγοράστηκαν από τα Cambridge Isotope Laboratories). Το μείγμα στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκε στις 15.000 × g για 10 λεπτά στους 4 °C και η κατώτερη φάση μεταφέρθηκε σε δύο σωλήνες (125 μL ο καθένας) για ανάλυση LC-MS σε θετική και αρνητική λειτουργία. Τέλος, το δείγμα εξατμίστηκε μέχρι ξηρού σε συμπυκνωτή κενού υψηλής ταχύτητας.
Οι αποξηραμένοι μεταβολίτες ανασυστάθηκαν σε 120 μl ακετονιτριλίου 80%, αναδεύτηκαν σε στροβιλισμό για 5 λεπτά και φυγοκεντρήθηκαν στις 15.000 × g για 10 λεπτά στους 4°C. Τα υπερκείμενα μεταφέρθηκαν σε φιαλίδια από κεχριμπαρένιο γυαλί με μικροένθετα για μελέτες μεταβολομικής. Μη στοχευμένη μεταβολομική ανάλυση σε πλατφόρμα υγρής χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης-φασματομετρίας μάζας υψηλής ανάλυσης (UPLC-HRMS). Οι μεταβολίτες διαχωρίστηκαν χρησιμοποιώντας ένα σύστημα Dionex Ultimate 3000 UPLC και μια στήλη αμιδίου ACQUITY BEH (2,1 × 100 mm, 1,7 μm, Waters). Σε λειτουργία θετικών ιόντων, οι κινητές φάσεις ήταν 95% (A) και 50% ακετονιτρίλιο (B), κάθε μία από τις οποίες περιείχε 10 mmol/L οξικό αμμώνιο και 0,1% μυρμηκικό οξύ. Σε αρνητική λειτουργία, οι κινητές φάσεις Α και Β περιείχαν 95% και 50% ακετονιτρίλιο, αντίστοιχα, και οι δύο φάσεις περιείχαν 10 mmol/L οξικό αμμώνιο, pH = 9. Το πρόγραμμα βαθμίδωσης ήταν το εξής: 0–0,5 λεπτά, 2% Β· 0,5–12 λεπτά, 2–50% Β· 12–14 λεπτά, 50–98% Β· 14–16 λεπτά, 98% Β· 16–16,1 λεπτά, 98–2% Β· 16,1–20 λεπτά, 2% Β. Η στήλη διατηρήθηκε στους 40°C και το δείγμα στους 10°C στον αυτόματο δειγματολήπτη. Ο ρυθμός ροής ήταν 0,3 ml/min, ο όγκος έγχυσης ήταν 3 μl. Ένα φασματόμετρο μάζας Q-Exactive Orbitrap (Thermo Fisher Scientific) με πηγή ιονισμού ηλεκτροψεκασμού (ESI) λειτούργησε σε λειτουργία πλήρους σάρωσης και συζεύχθηκε με τη λειτουργία παρακολούθησης ddMS2 για τη συλλογή μεγάλων όγκων δεδομένων. Οι παράμετροι MS ορίστηκαν ως εξής: τάση ψεκασμού +3,8 kV/- 3,2 kV, θερμοκρασία τριχοειδούς 320°C, αέριο θωράκισης 40 arb, βοηθητικό αέριο 10 arb, θερμοκρασία θερμαντήρα ανιχνευτή 350°C, εύρος σάρωσης 70–1050 m/h, ανάλυση 70.000. Τα δεδομένα αποκτήθηκαν χρησιμοποιώντας Xcalibur 4.1 (Thermo Fisher Scientific).
Για την αξιολόγηση της ποιότητας των δεδομένων, δημιουργήθηκαν συγκεντρωτικά δείγματα ποιοτικού ελέγχου (QC) αφαιρώντας 10 μL από το υπερκείμενο υγρό από κάθε δείγμα. Έξι ενέσεις δειγμάτων ποιοτικού ελέγχου αναλύθηκαν στην αρχή της αναλυτικής αλληλουχίας για να αξιολογηθεί η σταθερότητα του συστήματος UPLC-MS. Στη συνέχεια, εισάγονται περιοδικά δείγματα ποιοτικού ελέγχου στην παρτίδα. Και οι 11 παρτίδες δειγμάτων ορού σε αυτή τη μελέτη αναλύθηκαν με LC-MS. Κλάσματα ενός μείγματος ορού από 100 υγιείς δότες χρησιμοποιήθηκαν ως υλικό αναφοράς στις αντίστοιχες παρτίδες για την παρακολούθηση της διαδικασίας εκχύλισης και την προσαρμογή για επιδράσεις από παρτίδα σε παρτίδα. Η μη στοχευμένη μεταβολομική ανάλυση της ομάδας ανακάλυψης, της ομάδας εσωτερικής επικύρωσης και της ομάδας εξωτερικής επικύρωσης πραγματοποιήθηκε στο Κέντρο Μεταβολομικής του Πανεπιστημίου Sun Yat-sen. Το εξωτερικό εργαστήριο του Κέντρου Ανάλυσης και Δοκιμών του Τεχνολογικού Πανεπιστημίου Guangdong ανέλυσε επίσης 40 δείγματα από την εξωτερική ομάδα για να ελέγξει την απόδοση του μοντέλου ταξινομητή.
Μετά την εκχύλιση και την ανασύσταση, η απόλυτη ποσοτικοποίηση των μεταβολιτών του ορού μετρήθηκε χρησιμοποιώντας υγρή χρωματογραφία εξαιρετικά υψηλής απόδοσης-φασματομετρία μάζας tandem (τριπλό τετραπολικό Agilent 6495) με πηγή ιονισμού ηλεκτροψεκασμού (ESI) σε λειτουργία πολλαπλής παρακολούθησης αντιδράσεων (MRM). Χρησιμοποιήθηκε μια στήλη αμιδίου ACQUITY BEH (2,1 × 100 mm, 1,7 μm, Waters) για τον διαχωρισμό των μεταβολιτών. Η κινητή φάση αποτελούνταν από 90% (A) και 5% ακετονιτρίλιο (B) με 10 mmol/L οξικό αμμώνιο και 0,1% διάλυμα αμμωνίας. Το πρόγραμμα βαθμίδωσης ήταν το εξής: 0–1,5 λεπτά, 0% B· 1,5–6,5 λεπτά, 0–15% B· 6,5–8 λεπτά, 15% B· 8–8,5 λεπτά, 15%–0% B· 8,5–11,5 λεπτά, 0%B. Η στήλη διατηρήθηκε στους 40 °C και το δείγμα στους 10 °C στον αυτόματο δειγματολήπτη. Ο ρυθμός ροής ήταν 0,3 mL/min και ο όγκος έγχυσης ήταν 1 μL. Οι παράμετροι MS ορίστηκαν ως εξής: τριχοειδής τάση ±3,5 kV, πίεση νεφελοποιητή 35 psi, ροή αερίου θήκης 12 L/min, θερμοκρασία αερίου θήκης 350°C, θερμοκρασία αερίου ξήρανσης 250°C και ροή αερίου ξήρανσης 14 l/min. Οι μετατροπές MRM τρυπτοφάνης, πυροσταφυλικού, γαλακτικού, υποξανθίνης και ξανθίνης ήταν 205,0–187,9, 87,0–43,4, 89,0–43,3, 135,0–92,3 και 151,0–107,9 αντίστοιχα. Τα δεδομένα συλλέχθηκαν χρησιμοποιώντας το Mass Hunter B.07.00 (Agilent Technologies). Για τα δείγματα ορού, η τρυπτοφάνη, το πυροσταφυλικό, το γαλακτικό, η υποξανθίνη και η ξανθίνη ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας καμπύλες βαθμονόμησης πρότυπων διαλυμάτων μείγματος. Για τα δείγματα κυττάρων, η περιεκτικότητα σε τρυπτοφάνη ομαλοποιήθηκε ως προς το εσωτερικό πρότυπο και τη μάζα της κυτταρικής πρωτεΐνης.
Η εκχύλιση κορυφής (m/z και χρόνος κατακράτησης (RT)) πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας τα Compound Discovery 3.1 και TraceFinder 4.0 (Thermo Fisher Scientific). Για την εξάλειψη πιθανών διαφορών μεταξύ παρτίδων, κάθε χαρακτηριστική κορυφή του δείγματος δοκιμής διαιρέθηκε με τη χαρακτηριστική κορυφή του υλικού αναφοράς από την ίδια παρτίδα για να ληφθεί η σχετική αφθονία. Οι σχετικές τυπικές αποκλίσεις των εσωτερικών προτύπων πριν και μετά την τυποποίηση παρουσιάζονται στον Συμπληρωματικό Πίνακα 6. Οι διαφορές μεταξύ των δύο ομάδων χαρακτηρίστηκαν από ποσοστό ψευδούς ανακάλυψης (FDR <0,05, δοκιμασία κατάταξης Wilcoxon με πρόσημο) και αλλαγή πτυχής (>1,2 ή <0,83). Τα ακατέργαστα δεδομένα MS των εξαγόμενων χαρακτηριστικών και τα δεδομένα MS διορθωμένα ως προς τον ορό αναφοράς παρουσιάζονται στα Συμπληρωματικά Δεδομένα 1 και Συμπληρωματικά Δεδομένα 2, αντίστοιχα. Η σχολίαση κορυφής πραγματοποιήθηκε με βάση τέσσερα καθορισμένα επίπεδα ταυτοποίησης, συμπεριλαμβανομένων των ταυτοποιημένων μεταβολιτών, των πιθανώς σχολιασμένων ενώσεων, των πιθανώς χαρακτηρισμένων κατηγοριών ενώσεων και των άγνωστων ενώσεων 22. Με βάση τις αναζητήσεις στη βάση δεδομένων στο Compound Discovery 3.1 (mzCloud, HMDB, Chemspider), βιολογικές ενώσεις με επικυρωμένα πρότυπα που ταιριάζουν με MS/MS ή σχολιασμούς ακριβούς αντιστοίχισης στο mzCloud (βαθμολογία > 85) ή Chemspider επιλέχθηκαν τελικά ως ενδιάμεσα μεταξύ του διαφορικού μεταβολισμού. Οι σχολιασμοί κορυφής για κάθε χαρακτηριστικό περιλαμβάνονται στα Συμπληρωματικά Δεδομένα 3. Το MetaboAnalyst 5.0 χρησιμοποιήθηκε για μονοπαραμετρική ανάλυση της αφθονίας μεταβολιτών με κανονικοποίηση αθροίσματος. Το MetaboAnalyst 5.0 αξιολόγησε επίσης την ανάλυση εμπλουτισμού της οδού KEGG με βάση σημαντικά διαφορετικούς μεταβολίτες. Η ανάλυση κύριων συστατικών (PCA) και η μερική διακριτική ανάλυση ελαχίστων τετραγώνων (PLS-DA) αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το πακέτο λογισμικού ropls (v.1.26.4) με κανονικοποίηση στοίβας και αυτόματη κλιμάκωση. Το βέλτιστο μοντέλο βιοδεικτών μεταβολιτών για την πρόβλεψη κακοήθειας οζιδίων δημιουργήθηκε χρησιμοποιώντας δυαδική λογιστική παλινδρόμηση με ελάχιστη απόλυτη συρρίκνωση και τελεστή επιλογής (LASSO, πακέτο R v.4.1-3). Η απόδοση του διακριτικού μοντέλου στα σύνολα ανίχνευσης και επικύρωσης χαρακτηρίστηκε με την εκτίμηση της AUC με βάση την ανάλυση ROC σύμφωνα με το πακέτο pROC (v.1.18.0.). Η βέλτιστη αποκοπή πιθανότητας ελήφθη με βάση τον μέγιστο δείκτη Youden του μοντέλου (ευαισθησία + ειδικότητα – 1). Δείγματα με τιμές μικρότερες ή μεγαλύτερες από το όριο θα προβλεφθούν ως καλοήθεις όζοι και αδενοκαρκίνωμα πνεύμονα, αντίστοιχα.
Κύτταρα A549 (#CCL-185, American Type Culture Collection) αναπτύχθηκαν σε μέσο F-12K που περιείχε 10% FBS. Αλληλουχίες βραχείας φουρκέτας RNA (shRNA) που στοχεύουν το SLC7A5 και ένας μη στοχευόμενος έλεγχος (NC) εισήχθησαν στον φορέα λεντοϊού pLKO.1-puro. Οι αντινοηματικές αλληλουχίες του shSLC7A5 είναι οι εξής: Sh1 (5′-GGAGAAAACCTGATGAACAGTT-3′), Sh2 (5′-GCCGTGGACTTCGGGAACTAT-3′). Αντισώματα έναντι του SLC7A5 (#5347) και της τουμπουλίνης (#2148) αγοράστηκαν από την Cell Signaling Technology. Αντισώματα έναντι του SLC7A5 και της τουμπουλίνης χρησιμοποιήθηκαν σε αραίωση 1:1000 για ανάλυση Western blot.
Το Γλυκολυτικό Τεστ Στρες Seahorse XF μετρά τα επίπεδα εξωκυτταρικής οξίνισης (ECAR). Στη δοκιμασία, χορηγήθηκαν διαδοχικά γλυκόζη, ολιγομυκίνη Α και 2-DG για να ελεγχθεί η κυτταρική γλυκολυτική ικανότητα όπως μετρήθηκε από το ECAR.
Κύτταρα A549 που είχαν μεταμοσχευθεί με μη στοχευόμενο μάρτυρα (NC) και shSLC7A5 (Sh1, Sh2) τοποθετήθηκαν σε τρυβλία διαμέτρου 10 cm όλη τη νύχτα. Οι μεταβολίτες των κυττάρων εκχυλίστηκαν με 1 ml παγωμένης υδατικής μεθανόλης 80%. Τα κύτταρα στο διάλυμα μεθανόλης αποξέστηκαν, συλλέχθηκαν σε νέο σωλήνα και φυγοκεντρήθηκαν στις 15.000 × g για 15 λεπτά στους 4°C. Συλλέξτε 800 µl υπερκείμενου υγρού και ξηράνετε χρησιμοποιώντας συμπυκνωτή κενού υψηλής ταχύτητας. Τα αποξηραμένα σφαιρίδια μεταβολιτών αναλύθηκαν στη συνέχεια για επίπεδα τρυπτοφάνης χρησιμοποιώντας LC-MS/MS όπως περιγράφεται παραπάνω. Τα κυτταρικά επίπεδα NAD(H) σε κύτταρα A549 (NC και shSLC7A5) μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα ποσοτικό κιτ χρωματομετρίας NAD+/NADH (#K337, BioVision) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα επίπεδα πρωτεΐνης μετρήθηκαν για κάθε δείγμα για την ομαλοποίηση της ποσότητας των μεταβολιτών.
Δεν χρησιμοποιήθηκαν στατιστικές μέθοδοι για τον προκαταρκτικό προσδιορισμό του μεγέθους του δείγματος. Προηγούμενες μελέτες μεταβολομικής που στόχευαν στην ανακάλυψη βιοδεικτών15,18 έχουν θεωρηθεί ως σημεία αναφοράς για τον προσδιορισμό του μεγέθους και, σε σύγκριση με αυτές τις αναφορές, το δείγμα μας ήταν επαρκές. Κανένα δείγμα δεν εξαιρέθηκε από την ομάδα μελέτης. Τα δείγματα ορού ανατέθηκαν τυχαία σε μια ομάδα ανακάλυψης (306 περιπτώσεις, 74,6%) και μια ομάδα εσωτερικής επικύρωσης (104 περιπτώσεις, 25,4%) για μη στοχευμένες μελέτες μεταβολομικής. Επίσης, επιλέξαμε τυχαία 70 περιπτώσεις από κάθε ομάδα από το σύνολο ανακάλυψης για στοχευμένες μελέτες μεταβολομικής. Οι ερευνητές δεν γνώριζαν την ανάθεση ομάδων κατά τη συλλογή και ανάλυση δεδομένων LC-MS. Οι στατιστικές αναλύσεις των δεδομένων μεταβολομικής και των κυτταρικών πειραμάτων περιγράφονται στις αντίστοιχες ενότητες Αποτελέσματα, Υπόμνημα Σχήματος και Μέθοδοι. Η ποσοτικοποίηση της κυτταρικής τρυπτοφάνης, του NADT και της γλυκολυτικής δράσης πραγματοποιήθηκε τρεις φορές ανεξάρτητα με πανομοιότυπα αποτελέσματα.
Για περισσότερες πληροφορίες σχετικά με τον σχεδιασμό της μελέτης, ανατρέξτε στην Περίληψη της Έκθεσης Φυσικού Χαρτοφυλακίου που σχετίζεται με αυτό το άρθρο.
Τα ακατέργαστα δεδομένα MS των εξαγόμενων χαρακτηριστικών και τα κανονικοποιημένα δεδομένα MS του ορού αναφοράς εμφανίζονται στα Συμπληρωματικά Δεδομένα 1 και Συμπληρωματικά Δεδομένα 2, αντίστοιχα. Οι σχολιασμοί κορυφής για τα διαφορικά χαρακτηριστικά παρουσιάζονται στα Συμπληρωματικά Δεδομένα 3. Το σύνολο δεδομένων LUAD TCGA μπορεί να ληφθεί από τη διεύθυνση https://portal.gdc.cancer.gov/. Τα δεδομένα εισόδου για τη σχεδίαση του γραφήματος παρέχονται στα δεδομένα πηγής. Τα δεδομένα πηγής παρέχονται για αυτό το άρθρο.
Εθνική Ομάδα Μελέτης Προσυμπτωματικού Ελέγχου Πνεύμονα, κ.λπ. Μείωση της θνησιμότητας από καρκίνο του πνεύμονα με αξονική τομογραφία χαμηλής δόσης. Βόρεια Αγγλία. J. Med. 365, 395–409 (2011).
Kramer, BS, Berg, KD, Aberle, DR και Prophet, PC Έλεγχος καρκίνου του πνεύμονα με χρήση ελικοειδούς αξονικής τομογραφίας χαμηλής δόσης: αποτελέσματα από την Εθνική Μελέτη Ελέγχου Πνεύμονα (NLST). J. Med. Screen 18, 109–111 (2011).
De Koning, HJ, et al. Μείωση της θνησιμότητας από καρκίνο του πνεύμονα με ογκομετρικό αξονικό τομογράφο σε τυχαιοποιημένη δοκιμή. Βόρεια Αγγλία. J. Med. 382, 503–513 (2020).
Ώρα δημοσίευσης: 18 Σεπτεμβρίου 2023